Page 74 - 《广西植物》2026年第5期
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８ ０ ６ 广 西 植 物 ４６ 卷
荧光定量 ＰＣＲ 引物ꎬ序列见表 １ꎮ ＰＣＲ 的反应体 ＮＳｍ 基因的拷贝数ꎬ随后乘以稀释倍数 ５ꎬ即为各
系(总量 ２５ μＬ):２ ×Ａｃｃｕｒａｔｅ Ｔａｑ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２.５ 样本中 Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 基因的拷贝数ꎮ 按照公式计
μＬ、ｃＤＮＡ １ μＬ、引物上下游各 ０.５ μＬ、ｄｄＨ Ｏ １０.５ 算每个基因拷贝数的沉默效率ꎬ沉默效率(％) ＝
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μＬꎮ ＰＣＲ 程序:９４ ℃ 预变性 ３０ ｓꎻ９８ ℃ 变性 １０ ｓ、 (Ｃ－Ｔ) / Ｃ×１００( Ｃ 为仅接种 ＣＹＲＳＶ 病毒的植株
５４ ℃ 退火 ３０ ｓ、７２ ℃ 延伸 １ ｍｉｎꎬ共 ３４ 个循环ꎻ７２ 叶片中目的基因拷贝数的平均值ꎻＴ 为注射 ＶＩＧＳ
℃ 最终延伸 ２ ｍｉｎꎮ 扩增产物经 １.０％琼脂糖凝胶 沉默载体的植株叶片目的基因的平均拷贝数值)ꎮ
电泳 检 测ꎮ 将 扩 增 产 物 进 行 胶 回 收 后ꎬ 连 接 在
ｐＭＤ￣Ｔ１９ 克隆载体( 宝生物工程大连有限公司) ２ 结果与分析
上ꎬ反应体系如下:ｐＭＤ１９￣Ｔ Ｖｅｃｔｏｒ １ μＬ、ＤＮＡ 模
板 １ μＬ、ｄｄＨ Ｏ ３ μＬꎻ加入 ５ μＬ 的 Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ⅰꎮ 反 ２.１ ＣＹＲＳＶ Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 的 ＶＩＧＳ 载体构建及农
２
应程序为 １６ ℃ 反应 ３０ ｍｉｎ(ＰＣＲ 仪)ꎮ 将 ＰＣＲ 阳 杆菌转化结果
性克隆菌液送生工生物工程(上海) 股份有限公司 Ｎ、ＮＳｓ 和 ＮＳｍ 基因的 ＶＩＧＳ 靶片段大小分别
测序ꎬ经序列比对分析ꎬ测序正确的阳性克隆菌液 为 ３０７、３０３、３００ ｂｐꎬＰＣＲ 扩增后电泳观察目的条
® Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ Ｐｌｕｓ 高纯度质粒小
按照 Ｔｒｅｌｉｅｆ 带位置正确(图 １:Ａ)ꎬ并送生工生物工程( 上海)
提试剂盒进行质粒提取ꎬ最终获得 Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ / 股份有限公司测序ꎬ将测序比对成功的 ＰＣＲ 产物
ｐＭＤ￣Ｔ１９ 质粒标准品ꎻ对质粒标准品进行浓度测 进行胶回收ꎬ测浓度后备用ꎮ 将上一步回收的靶
定ꎬ依 据 拷 贝 数 的 计 算 公 式: 拷 贝 数 ( ｃｏｐｉｅｓ 片段与酶切回收后的 ｐＴＲＶ２ 载体进行同源重组ꎮ
￣１ ２３ ￣１ 经过转 化 筛 选ꎬ挑 选 单 克 隆 进 行 菌 落 ＰＣＲ 检 测
μＬ )＝ Ａ×６.０２×１０ / Ｂ[ Ａ 为质粒浓度( ｇμＬ )ꎻ
Ｂ 为质粒 ＤＮＡ 分子量( ｇｍｏｌ )]ꎬ计算出每个质 (图 １:Ｂ)ꎮ 将 ＰＣＲ 检测条带位置正确的阳性克隆
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粒标准品的病毒拷贝数ꎻ将 Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ / ｐＭＤ１９￣Ｔ 菌液送生工生物工程( 上海) 股份有限公司测序ꎬ
质粒梯度稀释成具有 １０ 倍浓度梯度的标准品ꎬ分 经序列比对分析ꎬ将测序正确的阳性克隆菌液扩
别用于建立 Ｎ、ＮＳｓ 和 ＮＳｍ 基因的标准曲线ꎮ 繁后进行质粒的抽取ꎬ最终成功获得重组载体质
以 ＣＹＲＳＶ￣ｑＮ￣Ｆ/ Ｒ、ＣＹＲＳＶ￣ｑＮＳｓ￣Ｆ/ Ｒ、ＣＹＲＳＶ￣ 粒 ｐＴＲＶ２￣Ｎ、 ｐＴＲＶ２￣ＮＳｓ、 ｐＴＲＶ２￣ＮＳｍꎮ 测 得
® ｐＴＲＶ２￣Ｎ 浓度为 ５４４.９４１ ｎｇμＬ ꎬｐＴＲＶ２￣ＮＳｓ 浓
￣１
ｑＮＳｍ￣Ｆ/ Ｒ 为 荧 光 定 量 ＰＣＲ 引 物ꎬ 采 用 ＳＹＢＲ
Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｏ Ｔａｑ ＨＳ 预混型 ｑＰＣＲ 试剂盒( 湖南艾科 度 为 ４９８. ８２２ ｎｇ μＬ ꎬ ｐＴＲＶ２￣ＮＳｍ 浓 度 为
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瑞生物工程有限公司) 进行荧光定量 ＰＣＲ 反应ꎬ ４８３.８００ ｎｇμＬ ꎮ 利用液氮速溶法ꎬ将上述质粒
荧光定量 ＰＣＲ 反应体系( 总量 １０ μＬ) 如下:标准 及 ｐＴＲＶ２￣ＰＤＳ 分别转入农杆菌 ＧＶ３１０１ 感受态细
品 １ μＬ、２×ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｐｒｏ Ｔａｑ ＨＳ Ｐｒｅｍｉｘ ５ μＬ、 胞中ꎬ挑选单克隆进行菌落 ＰＣＲ 检测( 图 １:Ｃ)ꎮ
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１０ μｍｏｌＬ 上下游引物各 ０.５ μＬ、ｄｄＨ Ｏ ３ μＬꎮ ＰＣＲ 条带位置正确ꎬ表明成功获 得 了 ｐＴＲＶ２￣Ｎ、
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反应条件:９５ ℃ 预变性 ３０ ｓꎬ９５ ℃ 变性 ５ ｓ、６０ ℃ ｐＴＲＶ２￣ＮＳｓ、ｐＴＲＶ２￣ＮＳｍ 及 ｐＴＲＶ２￣ＰＤＳ 重组载体
退火 ３０ ｓ(４０ 个循环)ꎬ９５ ℃ １５ ｓꎬ６０ ℃ １ ｍｉｎꎬ９５ 农杆菌菌液ꎬ可继续开展后续的沉默效率检测ꎮ
℃ １５ ｓꎮ 增加溶解曲线ꎬ以标准品的 ＣＴ 值作为纵 ２.２ Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 基因绝对实时荧光定量 ＰＣＲ 标
坐标ꎬ相应拷贝数的对数作为横坐标ꎬ建立 ＣＹＲＳＶ 准曲线的建立
Ｎ、ＮＳｓ 和 ＮＳｍ 基因的标准曲线ꎮ 以 ＣＹＲＳＶ￣ｑＮ、ｑＮＳｓ、ｑＮＳｍ 引物进行 ＰＣＲ 扩
１.６ Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 的 ＶＩＧＳ 载体沉默效率验证 增获得目的片段( 图 ２:Ａ)ꎬ将目的条带胶回收后
所采叶片样品总 ＲＮＡ 按照 ＳｔｅａｄｙＰｕｒｅ 植物 克隆到 ｐＭＤ１９￣Ｔ 载体上ꎬ经菌落 ＰＣＲ( 图 ２:Ｂ) 后
ＲＮＡ 提取试 剂 盒 ( 湖 南 艾 科 瑞 生 物 工 程 有 限 公 将测序正确的阳性克隆进行质粒提取ꎬ最终成功
司)说明书进行提取ꎮ 将总 ＲＮＡ 按照 Ｅｖｏ Ｍ￣ＭＬＶ 获 得 Ｎ / ｐＭＤ１９￣Ｔ、 ＮＳｓ/ ｐＭＤ１９￣Ｔ、 ＮＳｍ / ｐＭＤ１９￣Ｔ
反转录预混型试剂盒( 湖南艾科瑞生物工程有限 重组载体ꎬ浓度分别为 ２９８. ５、３５５. ７、４２９. ０ ｎｇ
公司)说明书进行反转录ꎬ各样本 ｃＤＮＡ 稀释 ５ 倍 μＬ ꎮ 利用公式计算出 Ｎ / ｐＭＤ１９￣Ｔ、ＮＳｓ/ ｐＭＤ１９￣Ｔ
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后待用ꎬ荧光定量 ＰＣＲ 检测步骤同 １.５ꎮ 各样品中 和 ＮＳｍ / ｐＭＤ１９￣Ｔ 质 粒 的 拷 贝 数 分 别 为 ０. ９４ ×
Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 基因的拷贝数计算:将待测样品 ＣＴ １０ 、１.１０×１０ 和 １.１０ × １０ ꎮ 依次将标准质粒稀
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值代入对应标准曲线中ꎬ计算待测样品中 Ｎ、ＮＳｓ、 释成 ８ 个拷贝数浓度ꎬＮ / ｐＭＤ１９￣Ｔ 质粒的拷贝数
