Page 79 - 《广西植物》2026年第5期

５ 期 李妤等: 辣椒黄化环斑病毒主要功能基因 Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 的 ＶＩＧＳ 体系构建及效率验证 ８ １ １

迫在眉睫ꎮ 为了解 ＣＹＲＳＶ 主要蛋白的功能作用ꎬ ＣＹＲＳＶ 接种后马上注射 ＶＩＧＳ 体系这种模式ꎬ由于
进一步探索 ＣＹＲＳＶ 的侵染机制ꎬ本研究通过设计 病毒和 ＶＩＧＳ 体系前两天都同时处于扩繁和积累
并构建高效的 ＣＹＲＳＶ 主要功能蛋白 ＶＩＧＳ 体系ꎬ 的准备阶段ꎬ当 ＶＩＧＳ 在发挥作用的最佳时期ꎬ病
运用绝对荧光定量 ＰＣＲ 技术验证 ＶＩＧＳ 体系的沉 毒也同样处于繁殖最佳时期ꎬ因此沉默效率也会
默效率ꎬ为后续研究 ＣＹＲＳＶ 主要功能蛋白的作用 减弱ꎮ 但是ꎬ先接种病毒后 ２ ｄ 注射 ＶＩＧＳ 体系这
提供材料支撑ꎬ也为解析 ＣＹＲＳＶ 致病机制提供理 种模式ꎬ由于病毒先通过 ２ ｄ 的积累复制时间ꎬ体

论支持ꎮ 内病毒可能已经充分繁殖和活跃ꎬ病毒繁殖正处
目前ꎬＶＩＧＳ 技术已成熟并广泛应用于烟草、玉 于上升阶段ꎬ再注射 ＶＩＧＳ 体系的话ꎬ沉默效率就
米、水稻、拟南芥、小麦和番茄等多种作物ꎬ将作物 会大大减弱ꎮ 通过以上摸索实验ꎬ我们选择 ＶＩＧＳ
的内源基因沉默以研究其对植物生长发育及其他 体系注射 ２ ｄ 后再接种 ＣＹＲＳＶ 的最佳模式ꎬ进一
功能影响的研究已比较丰富ꎮ 但是ꎬ关于植物病 步在本氏烟和辣椒中进行验证ꎮ 通过绝对荧光定
毒相关基因的 ＶＩＧＳ 体系研究报道仍然不多ꎬ而构 量 ＰＣＲ 检测发现 Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 基因在本氏烟中的
建 ＣＹＲＳＶ 主要功能蛋白编码基因的 ＶＩＧＳ 体系研 沉默效率分别为 ８２.０７％、８７.０２％、９４.３９％ꎬ在辣
究尚未见报道ꎮ ＶＩＧＳ 体系主要是利用含烟草脆裂 椒中 的 沉 默 效 率 分 别 为 ８６. ６３％、 ８９. ２２％、 ８３.
病毒( ｔｏｂａｃｃｏ ｒａｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓꎬ ＴＲＶ) 功 能 基 因 的 载 体 ４３％ꎮ 邱润霜等(２０２０) 报道了先注射 ＶＩＧＳ 载体
(ｐＴＲＶ１ 和 ｐＴＲＶ２) 来实现ꎬ目的基因靶片段主要 后接种病毒和先接种病毒后注射 ＶＩＧＳ 载体 ２ 种
克隆到 ｐＴＲＶ２ 载体上ꎬ随后与 ｐＴＲＶ１ 一起共同侵 方法对 ＴＳＷＶ 的沉默效果ꎬ发现先注射载体后接
染植株ꎬ达到使目的基因表达沉默的效果ꎮ 本研 种病毒的方式要比先接种病毒后注射载体的方式
究将 ＣＹＲＳＶ Ｎ、ＮＳｓ 和 ＮＳｍ 基因的 ３００ ｂｐ 左右靶 沉默效率高ꎬ这与本文检测结果一致ꎮ 本文所构
片段扩增后构建到 ｐＴＲＶ２ 载体上ꎬ与 ｐＴＲＶ１ 载体 建 Ｎ、ＮＳｓ、ＮＳｍ 基因的 ＶＩＧＳ 体系的沉默效 率 在
共同注射到本氏烟和辣椒叶片中ꎬ显著降低了病 ８２％至 ９５％之间ꎬ再次证明了先注射 ＶＩＧＳ 载体后
毒的 Ｎ、ＮＳｓ 和 ＮＳｍ 基因的拷贝数ꎬ实现了基因沉 接种病 毒 方 式 的 可 行 性 和 高 效 性ꎬ 原 因 可 能 是
默的效果ꎮ 我们设计的靶片段长度均在 ３００ ｂｐ 左 ＶＩＧＳ 载体注射过后会在 ４８ ~ ９６ ｈ 时复制达高峰ꎬ
右ꎬ沉默效率较高ꎬ这与以往文献报道的将基因全 这时如果接种病毒ꎬ病毒基因表达会在早期就被
长编码序列及其中 １５０ ｂｐ 左右序列构建到 ＶＩＧＳ 沉默干扰ꎬ进而影响病毒复制和装配ꎬ达到高效沉
载体上 的 情 况 不 同ꎬ 靶 片 段 太 小 或 太 长 不 利 于 默的目的ꎮ 反之ꎬ如果病毒接种后才注射 ＶＩＧＳ 载
ＰＣＲ 扩增ꎬ容易造成片段不纯或碱基突变ꎬ并且在 体ꎬ可能病毒已经在宿主中进行复制和装配ꎬ产生
侵染植 株 后 容 易 造 成 脱 靶ꎬ 导 致 基 因 沉 默 效 率 了许多病毒粒子ꎬ这时注射 ＶＩＧＳ 载体ꎬＶＩＧＳ 体系
不高ꎮ 只能沉默部分病毒基因ꎬ或者病毒复制速度大于
本研 究 采 用 ５ 种 不 同 的 接 种 模 式 来 验 证 ＶＩＧＳ 沉默 作 用ꎬ进 而 导 致 ＶＩＧＳ 沉 默 效 率 不 高ꎮ
ＣＹＲＳＶ ３ 种基因 ＶＩＧＳ 体系在本氏烟中的沉默效 此外ꎬ在大田条件下ꎬ病毒的侵染具有随机性ꎬ延
率ꎬ其中沉默效率最高的模式是 ＶＩＧＳ 体系注射 ２ 续的时间会很长ꎮ 作为预防措施ꎬ更需要提前进
ｄ 后接 种 ＣＹＲＳＶꎬ 其 次 沉 默 效 率 较 好 的 模 式 是 行预防免疫接种ꎬ因此先注射 ＶＩＧＳ 体系后接种病
ＣＹＲＳＶ 接种后马上注射 ＶＩＧＳ 体系以及 ＶＩＧＳ 体 毒是达到病毒高效沉默的因素之一ꎮ ＶＩＧＳ 技术的
系注射 ５ ｄ 后接种 ＣＹＲＳＶꎬ而 ＣＹＲＳＶ 接种 ２ ｄ 后 沉默效率在很大程度上依赖于寄主植物与病毒间
注射 ＶＩＧＳ 体 系 和 ＶＩＧＳ 体 系 注 射 ８ ｄ 后 接 种 的相互作用ꎬ除此之外ꎬＶＩＧＳ 技术的沉默效率与
ＣＹＲＳＶ 的模式下沉默效率较低ꎬ甚至沉默无显著 寄主的生长环境、病毒积累的环境也紧密相关( 李
性差异ꎮ 分析其原因可能是由于 ＶＩＧＳ 体系在植 姣等ꎬ２０１９)ꎮ 本研究中的实验都严格在恒温恒湿
株中发挥作用至少需要 ２ ｄꎬ２ ｄ 后接种病毒效果 的温室中进行ꎬＶＩＧＳ 侵染液吸光度值严格控制在
最佳ꎻ而 ＶＩＧＳ 注射时间大于 ２ ｄ 或过长再接种病 ０.６ꎬ高浓度的菌液会造成植物死亡( 胡锦瑜等ꎬ
毒ꎬ由于 ＶＩＧＳ 体系是瞬时接种ꎬ注射时间过长且 ２０２４)ꎮ 另外ꎬ病毒在植株内的侵染和复制特点也
体内没有病毒的情况下ꎬ就会导致 ＶＩＧＳ 在植株内 应该考虑在内ꎬ因为 ＶＩＧＳ 体系沉默植株内源基因
作用 不 是 最 佳 时 机ꎬ 沉 默 效 率 就 可 能 降 低ꎻ 而 和沉默外源病毒基因的时间存在差异ꎬ植株内源