Page 124 - 《广西植物》2020年第10期
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１０ 期 李歌等: 昌化江河谷隔离对海南岛特有植物盾叶苣苔遗传多样性的影响 １ ５ ０ ７
群的 系 统 发 育 与 种 群 遗 传 学 研 究 ( 段 义 忠 等ꎬ 苷酸多样性( π)、种群间平均基因流( Ｎ ) 和居群
ｍ
２０１０ꎻ 王晓雄等ꎬ ２０１１)ꎮ 本研究选用 ＩＴＳ 标记分 间遗传分化系数( Ｆ )ꎮ 采用 ＰＥＲＭＵＴ ( Ｐｏｎｓ ＆
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析海南特有种盾叶苣苔的种群遗传多样性与遗传 Ｐｅｔｉｔꎬ １９９６) 软 件 计 算 种 群 内 平 均 遗 传 多 样 性
结构ꎬ探究海南岛地理格局对盾叶苣苔种群遗传 (Ｈ )、物种水平总遗传变异( Ｈ )ꎬ以及遗传分化
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变异水平与空间分布的影响ꎬ为海南特有种的起 系数(Ｇ 和 Ｎ )ꎮ Ｇ 只考虑单倍型的频率ꎬＮ 考
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源、进化和保育提供理论基础ꎮ 虑了 单 倍 型 的 频 率 和 序 列 差 异 ( Ｒａｙｍｏｎｄ ＆
Ｒｏｕｓｓｅｔꎬ １９９５)ꎮ Ｎ 大于 Ｇ 通常表明种群存在谱
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１ 材料与方法 系地理结构ꎬ其显著性通过１ ０００次置换进行检验ꎮ
使用 ＧｅｎＡｌＥｘ ６.５ ( Ｐｅａｋａｌｌ ＆ Ｓｍｏｕｓｅꎬ ２０１２) 进行
１.１ 材料
ＡＭＯＶＡ ( Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｖａｒｉａｎｃｅ) 分 析ꎬ将
本研究采集了盾叶苣苔 １１ 个种群共 １７２ 份样
总遗传变异在种群内、种群间与地区间三个层次
本ꎬ采样点覆盖该种在海南岛的主要分布地点( 韦
上进行剖分ꎮ 用 Ｍａｎｔｅｌ 检验( Ｍａｎｔｅｌꎬ １９６７) 比较
毅刚ꎬ ２０１０)ꎮ 野 外 采 集 生 长 良 好、 无 病 斑 的 幼
盾叶苣苔种群遗传距离与地理距离之间的相关
叶ꎬ用硅胶快速干燥后带回实验室ꎬ每种群采集
性ꎬ通过１０ ０００次随机重复检验显著性ꎮ 采用 Ｎｅｔ￣
１１ ~ ２１ 个体( 表 １)ꎮ 昌化江及其支流将这 １１ 个
ｗｏｒｋ ５.０ ( Ｂａｎｄｅｌｔꎬ １９９９) 的中点连接法( Ｍｅｄｉａｎ￣
种群分 割 在 ３ 块 不 连 续 的 区 域 中ꎬ 其 中 猕 猴 岭
ｊｏｉｎｉｎｇ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ) 对盾叶苣苔 １１ 个种群构建单倍
(ＪＸ)、鹦哥岭( ＹＧ)、霸王岭( ＢＷ)、南高岭( ＮＧ)
型网络图ꎮ 种群遗传结构用 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ２.３.４ 分析ꎬ
与黎母山( ＬＭ) 种群位于昌化江以北侧ꎬ尖峰岭
ＭＣＭＣ 链起始的 １０ 世代不计入似然值计算ꎬ随后
５
(ＪＦ)与仙安石林( ＸＡ) 种群大体位于昌化江的西
重复抽样 １０ 世代ꎮ Ｋ 代表遗传成分的种数ꎬ其取
６
南ꎬ其余种群分布在昌化江的东南ꎮ 同侧种群被
值范围设置为 １ ~ １１ꎬ对于每个 Ｋ 重复 １０ 次聚类
沟谷与河流进一步分割(图 １)ꎮ
分析ꎬ将 １０ 次运算的平均似然值作为每个 Ｋ 的似
１.２ ＤＮＡ 提取和 ＰＣＲ 扩增、测序
然值ꎮ 聚类模型假定种群可以混合ꎬ且等位基因
采用改良的 ＣＴＡＢ 法 ( Ｄｏｙｌｅꎬ １９９０)ꎬ从硅胶
频率 是 相 关 的 ( Ｐｒｉｔｃｈａｒｄ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０００ )ꎮ 使 用
干燥 的 叶 片 中 提 取 总 ＤＮＡꎮ 由 通 用 引 物 ＩＴＳ４
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｈａｒｖｅｓｔｅｒ 进行 ＤｅｌｔａＫ 作图分析ꎬ以确定
(５′ ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ ３′) 和 ＩＴＳ ５ＨＰ
最优 Ｋ 值ꎬ即最可能的遗传成分的数目( Ｅｖａｎｎｏ ｅｔ
(５′ ＧＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＴＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ ３′) ( Ｗｈｉｔｅ
ａｌ.ꎬ ２００５ )ꎮ 将 Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ 输 出 结 果 上 传 至
ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９０)扩增盾叶苣苔的 ＩＴＳ 片段ꎮ
ＰＣＲ 扩增体系为 ２５ μＬꎬ包括 １７ μＬ 去离子 ＣＬＵＭＰＡＫ ｓｅｒｖｅｒ 绘 制 遗 传 结 构 图 ( Ｊａｋｏｂｓｓｏｎ ＆
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇꎬ ２００７)ꎮ 基于 Ｎｅｉ 遗传距离使用 ＭＥＧＡ
水ꎬ２. ５ μＬ １０ × 缓 冲 液ꎬ ０. ５ μＬ １０ ｍＭ ｄＮＴｐｓꎬ
￣１ ６.０ 中的邻接法构建盾叶苣苔地理种群的聚类关
５ μｍｏｌＬ 引物各 ０.５ μＬꎬ１ μＬ ＤＮＡ 模板和 ０.５
μＬ ５ ＵμＬ Ｔａｑ 酶ꎮ ＩＴＳ 片段扩增程序:９４ ℃ 预 系图(Ｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎮ
￣１
变性 ４ ｍｉｎꎻ９４ ℃ 变性 １ ｍｉｎꎬ５５ ℃ 退火 ４０ ｓꎬ７２ ℃
２ 结果与分析
延伸 １ ｍｉｎꎬ循环 ３６ 次ꎬ最后 ７２ ℃ 延伸 １０ ｍｉｎꎮ
ＰＣＲ 产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送广州天一辉
远生物科技有限公司测序ꎮ ２.１ 序列变异
１.３ 数据统计分析 经比对ꎬＩＴＳ 序列的长度为 ６４７ ｂｐꎬ一共检测
先用 ＣｏｎｔｉｇＥｘｐｒｅｓｓ ２０１４ 对 测 序 结 果 手 工 校 到 ６４ 个变异位点ꎬ包括 ７ 个碱基插入缺失突变ꎮ
正ꎬ然后通过 ＭＥＧＡ ６.０ (Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００８)程序 种群 ＢＭ 和 ＱＸ 的变异位点比例最高ꎬ为 ０.９２％ꎻ
构建序列比对ꎮ 用 ＤｎａＳＰ ５.１ ( Ｌｉｂｒａｄｏ ＆ Ｒｏｚａｓꎬ 种群 ＮＧ 的 ＩＴＳ 序列没有变异ꎻ其余种群的变异位
２００９)确定单倍型ꎬ并计算单倍型多样性( Ｈ )、核
ｄ 点比例在 ０.１５％ ~ ０.７７％之间(表 １)ꎮ
