Page 100 - 《广西植物》2020年第4期
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５ ３ ８ 广 西 植 物 ４０ 卷
等ꎬ２００８ꎻ阮君山ꎬ２００２)ꎮ 目前ꎬ对阴地蕨的研究 １.３ Ｄｅ ｎｏｖｏ(从头) 组装
较少ꎬ主要集中在化学成分、临床及药理作用、分 将测序得到的原始序列( ｒａｗ ｒｅａｄｓ) 去除低质
类及分布调查等方面ꎬ分子生物学相关的信息较 量、接头污染以及未知碱基 Ｎ 含量过高的序列得
少ꎬ限制了更深入的研究ꎮ 转录组( ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ) 到干 净 序 列 ( ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ )ꎬ 使 用 Ｔｒｉｎｉｔｙ 软 件
是指某一生理条件下ꎬ细胞内所有转录产物的集 (ｖ２.０.６) ( Ｇｒａｂｈｅｒｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１１ ) 对 ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ 进
合ꎬ包括信使 ＲＮＡ(ｍＲＮＡ)、核糖体 ＲＮＡ( ｒＲＮＡ)、 行 Ｄｅ ｎｏｖｏ 组装ꎬ 使用 Ｔｇｉｃｌ 软件( ｖ２.０.６) ( Ｐｅｒｔｅａ
转运 ＲＮＡ ( ｔＲＮＡ) 及 非 编 码 ＲＮＡ ( ｎｏｎｅ ｃｏｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００３)将组装的转录本进行聚类去冗余ꎬ得
ＲＮＡ)ꎮ 随着测序技术的发展和普及ꎬ转录组测序 到单一基因(Ｕｎｉｇｅｎｅ)用于后续分析ꎮ
(ＲＮＡ￣ｓｅｑ)已经成为从分子水平研究生物基因及 １.４ Ｕｎｉｇｅｎｅ 功能注释及分析
其调控的重要方法ꎮ 本研究通过高通量测序获得 为了解 Ｕｎｉｇｅｎｅ 的 功 能ꎬ用 生 信 分 析 软 件 将
阴地蕨全转录组ꎬ通过生物信息学方法对其进行 Ｕｎｉｇｅｎｅ 在七大功能数据库中进行注释:用 Ｂｌａｓｔ
分析ꎬ得到阴地蕨转录组的整体注释信息、筛选出 (ｖ２. ２. ２３ ) 进 行 ＮＴ、 ＮＲ、 ＣＯＧ、 ＫＥＧＧ 注 释ꎻ 用
植物激素信号转导相关的潜在基因及其单核苷酸 ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ 注 释ꎻ 用 Ｂｌａｓｔ２ＧＯ ( ｖ２. ５. ０) ( Ｃｏｎｅｓａ ｅｔ
多态性( ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍꎬ ＳＮＰ) 和短 ａｌ.ꎬ ２００５) 以及 ＮＲ 注释结果进行 ＧＯ 注释ꎻ用 Ｉｎ￣
序 列 重 复 多 态 性 ( ｓｈｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ ｐｏｌｙｍｏｒ￣ ｔｅｒＰｒｏＳｃａｎ５ (ｖ５.１１－５１.０) (Ｑｕｅｖｉｌｌｏｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００５)
ｐｈｉｓｍꎬ ＳＳＲ)等信息ꎬ为进一步从分子水平开展阴 进 行 ＩｎｔｅｒＰｒｏ 注 释ꎮ 根 据 ＫＥＧＧ 信 号 途 径
地蕨生 长 发 育、 品 种 鉴 定 等 研 究 提 供 了 有 用 的 ｍａｐ０４０７５ꎬ将经注释的相关基因进行归类ꎬ即得植
资源ꎮ 物激素信号转导相关基因ꎮ
１.５ 转录组结构分析
１ 材料与方法 １.５.１ 编码序列( ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓꎬＣＤＳ) 预测 根
据功能注释结果ꎬ按照 ＮＲ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＫＥＧＧ、ＣＯＧ
１.１ 材料 的数据库优先顺序ꎬ挑选 Ｕｎｉｇｅｎｅ 的最佳比对片段
新鲜、成熟阴地蕨植物全株 ３ 株(包含根、茎、 作为该 Ｕｎｉｇｅｎｅ 的 ＣＤＳ ꎮ 未能注释上的 Ｕｎｉｇｅｎｅ
叶及孢子ꎬ于 ２０１６ 年 ７ 月采于贵州省黔南州都匀 使用预测得到的 ＣＤＳ 作为模型进行建模ꎬ然后使
市郊斗篷山地区(１０７°２０′—１０７°２７′ Ｅ、２６°１２′— 用 ＥＳＴＳｃａｎ (ｖ３.０.２) (Ｉｓｅｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９９)进行 ＣＤＳ
２６°１６′ Ｎꎬ海拔约 １ ５００ ｍ)ꎬ经黔南医学高等专科 预测ꎮ
学校王传明副教授鉴定为阴地蕨( Ｂｏｔｒｙｃｈｉｕｍ ｔｅｒ￣ １.５.２ 转录因子(ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｆａｃｔｏｒꎬＴＦ)编码能力预测
ｎａｔｕｍ)ꎮ 样品采集后ꎬ立即用清水冲洗干净ꎬ吸水 首先ꎬ用 ｇｅｔｏｒｆ( ＥＭＢＯＳＳ:６.５.７.０) ( Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ.ꎬ
纸吸干后放入干冰盒中带回ꎬ以备提取 ＲＮＡꎮ ２０００) 检 测 Ｕｎｉｇｅｎｅ 的 开 放 阅 读 框 ( ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ
１.２ ｃＤＮＡ 文库制备及测序 ｆｒａｍｅꎬＯＲＦ)ꎻ然后ꎬ使用 ｈｍｍｓｅａｒｃｈ( ｖ３.０) ( Ｍｉｓｔｒｙ
将植物全株用液氮研磨成粉末ꎬ用 ＲＮＡ 提取 ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３) 将 ＯＲＦ 比对到转录因子蛋白结构域
试剂盒(艾德莱公司ꎬ北京)提取总 ＲＮＡ 并将 ＤＮＡ (数据来源于 ＰｌａｎｔＴＦＤＢ)ꎻ最 后ꎬ根 据 ＰｌａｎｔＴＦＤＢ
消化ꎬ用带有寡聚脱氧胸腺嘧啶( Ｏｌｉｇｏ ｄＴ) 的磁珠 描述的转录因子家族特征对 Ｕｎｉｇｅｎｅ 进行 ＴＦ 编码
富集 ｍＲＮＡꎬ 经 琼 脂 糖 电 泳 及 微 量 核 酸 检 测 仪 能力鉴定(Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ
ＮａｎｏＤｒｏｐ 检测合格后用试剂盒依次合成 ｃＤＮＡ、纯 １.５. ３ ＳＳＲ 和 ＳＮＰ 检 测 首 先ꎬ用 ＭＩＳＡ ( ｖ１. ０)
化、修复粘性末端、在 ３′末端加上碱基“ Ａ” 并连接 (Ｔｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００３) 对 Ｕｎｉｇｅｎｅ 进行 ＳＳＲ 检测ꎻ然
接头ꎬ然后进行片段大小选择ꎬ最后进行 ＰＣＲ 扩 后ꎬ用 ＨＩＳＡＴ( ｖ０.１.６￣ｂｅｔａ) ( Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５) 把
增构建 ｃＤＮＡ 文库ꎻ构建好的文库经检验合格后上 ｃｌｅａｎ ｒｅａｄｓ 比 对 到 Ｕｎｉｇｅｎｅꎻ 最 后ꎬ 使 用 ＧＡＴＫ
Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００ 平台进行测序ꎮ (ｖ３.４￣０)(ＭｃＫｅｎｎａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１０) 检测 ＳＮＰꎮ
