Page 104 - 《广西植物》2020年第7期

１ ０ ０ ０ 广 西 植 物 ４０ 卷
ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００３)ꎮ 本文选择基部被子植物中的北美 和 １８Ｓ ｒＲＮＡ 两条带亮度为 １.５ ~ ２ 倍ꎬ无弥散片
鹅掌楸为材料ꎬ采用 ＲＡＣＥ 法克隆出 ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ 家 状、条带消失ꎬ则说明 ＲＮＡ 完整性较好ꎮ ＲＮＡ 浓
族 ＬｔＴＣＸ２ 基因ꎬ并对其组织特异性表达和生物信 度检测使用微量分光光度计( ＮＡＮＯＤＲＯＰ ２０００ꎬ
息学进行分析ꎬ以期为后人研究北美鹅掌楸 ＣＰＰ￣ ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ 公司)ꎬ若 ＯＤ２６０ / ２８０、ＯＤ２６０ / ２３０ 比
ｌｉｋｅ 家族基因、花的发育调控提供一定的研究理论 值处于 １.８ ~ ２.１ 之间ꎬ说明 ＲＮＡ 质量较好ꎮ 反转
基础ꎻ结合 ＬｔＴＣＸ２ 基因的系统进化分析ꎬ初步探 录采用 １０ μＬ 体系ꎬ反转录酶 ５ × ＰｒｉｍｅｒＳｃｒｉｐｔ ＲＴ
索该基因在植物中的理论进化过程ꎬ以期为鹅掌 Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 加入 ２ μＬꎬＲＮＡ 使用 ５００ ｎｇꎬｄｄＨ Ｏ 补
２
楸属植物在被子植物中的地位提供分析生物学层 足 １０ μＬꎬ轻柔混匀ꎮ 反转录反应条件:３７ ℃ 反应
面的新思路及依据ꎮ １５ ｍｉｎꎬ８５ ℃ 反转录酶失活 ５ ｓꎬ４ ℃ 终止反应ꎬ所
得即为 ｃＤＮＡ 第一条链ꎬ用作克隆目的基因中间片
１ 材料与方法 段的模板ꎬ－２０ ℃ 保存备用ꎮ ３′ＲＡＣＥ、５′ＲＡＣＥ 所
使用的 ｃＤＮＡ 分别参照 ３′￣Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ ｗｉｔｈ
１.１ 材料与试剂 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐ ＲＴａｓｅ Ｋｉｔ、 ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ５′ / ３′ Ｋｉｔ 说
材料:北美鹅掌楸选自位于江苏省镇江市句 明书进行ꎮ
容下蜀的南京林业大学实习林场基地鹅掌楸属种 １.３ 引物合成与测序

源试验林ꎬ均为成年ꎬ树龄为 ２７ ａꎮ 试验林营建于 所用引物均由南京金斯瑞生物科技有限公司
１９９３ 年ꎬ地理位置为 １１９°１４′Ｅ、３１°５９′Ｎꎮ 采集北 完成ꎬ测序由上海杰李生物技术有限公司完成ꎮ
美鹅掌楸新鲜的花芽、根、茎、叶、萼片、花 瓣、雄 １.４ 北美鹅掌楸 ＬｔＴＣＸ２ 基因全长克隆
蕊、雌蕊ꎬ做好标记ꎬ迅速置于液氮中ꎬ带回实验 在本实验室的北美鹅掌楸转录组测序数据库
室ꎬ存于－８０ ℃ 超低温冰箱中保存ꎮ 中根 据 ＮＲ 功 能 注 释ꎬ 挑 选 一 条 ＣＰＰ￣ｌｉｋｅ 家 族
试剂:多糖多酚植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒( 离 ＴＳＯ１￣ｌｉｋｅ 的 ｕｎｉｇｅｎｅꎬ 基 因 ＩＤ 为 ｃ１０８０７８. ｇｒａｐｈ ＿
心柱型)购自天根生化科技(北京)有限公司ꎻ巯基 ｃ０ꎬ共 ３ １７４ ｂｐꎮ 使用 Ｏｌｉｇｏ７ 设计中间片段引物ꎬ

乙醇购 自 上 海 捷 瑞 生 物 工 程 有 限 公 司ꎻ ｐＥＡＳＹ￣ 以 ｃＤＮＡ 为 模 板ꎬ 高 保 真 酶 为 Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ￣
Ｂｌｕｎｔ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔ 克隆载体试剂盒、ＥａｓｙＰｕｒｅ Ｑｕｉｃｋ Ｆｒｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬ配制 ５０ μＬ 体系的反应
Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ 切胶回收试剂盒、大肠杆菌菌株 液ꎮ ＰＣＲ 反应程序:９５ ℃ 预变性 ３ ｍｉｎꎬ９５ ℃ 变性

Ｔｒａｎｓ１￣Ｔ１ ｐｈａｇｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ ｃｅｌｌ １５ ｓꎬ退火 １５ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ６０ ｓ/ ｋｂꎬ３５ 个循环ꎬ７２
感受态、Ｘ￣ｇａｌ、核酸染料 Ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ 均购自北京全式 ℃ 彻底延伸 ５ ｍｉｎꎬ４ ℃ 终止反应ꎮ 使用 １.５％琼脂
金生物技术有限公司ꎻＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＴＭ ＲＴ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ 凝胶电泳检测 ＰＣＲ 产物ꎬ１２０ Ｖ 电压电泳 ４０ ｍｉｎꎬ
(Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ)、 ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ５′ / ３′ Ｋｉｔ 和 于凝胶成像仪中拍照并切下含有目的片段的凝
３′￣Ｆｕｌｌ ＲＡＣＥ Ｃｏｒｅ Ｓｅｔ ｗｉｔｈ ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐ ＲＴａｓｅ Ｋｉｔ 均 胶ꎬ参照 ＥａｓｙＰｕｒｅ Ｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ 说明书

购自 ＴＡＫＡＲＡ 公司ꎻＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒ、Ｇｒｅｅｎ Ｔａｑ Ｍｉｘ、 进行目的片段回收ꎮ 将目的片段连接到 ｐＥＡＳＹ￣
Ｐｈａｎｔａ Ｍａｘ Ｓｕｐｅｒ￣Ｆｒｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ 均购自 Ｂｌｕｎｔ 载体中ꎬ并转化大肠杆菌 Ｔｒａｎｓ１￣Ｔ１ 感受态细
南京诺唯赞生物科技有限公司ꎻ琼脂糖 Ａｇａｒｏｓｅ 购 胞ꎬ均匀涂在加入抗生素的 ＬＢ 平板上ꎬ３７ ℃ 过夜

自北京擎科生物技术公司ꎻ无水乙醇等其他化学 培养ꎬ进行蓝白斑筛选ꎬ对 ８ 个菌落进行 ＰＣＲ 检
试剂均为国产或进口分析纯ꎮ 测ꎬ使用 Ｍ１３ 通用引物ꎬ挑选 ３ 个片段大小正确的
１.２ 北美鹅掌楸组织总 ＲＮＡ 提取及反转录 阳性菌落送至公司测序ꎮ 获得正确的中间片段
北美鹅掌楸根、茎、叶等组织的总 ＲＮＡ 提取主 后ꎬ设计 ３′ＲＡＣＥ、５′ＲＡＣＥ引物ꎬ采用巢式 ＰＣＲ 扩
要按照多糖多酚植物总 ＲＮＡ 提取试剂盒( 离心柱 增ꎬ反应体系、ＰＣＲ 条件、连接转化、菌落检测与中
型)说明书进行ꎬ所得产物于－８０ ℃ 超低温冰箱中 间片段扩增相同ꎮ 将中间片段、３′ＲＡＣＥ、５′ＲＡＣＥ
保存ꎮ ＲＮＡ 完整性使用 １％凝胶电泳检测ꎬ若 ２８Ｓ 所得序列使用 ＢｉｏＸＭ ２.６ 软件进行拼接ꎬ获得基因