Page 105 - 《广西植物》2020年第7期
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７ 期 刘换换等: 北美鹅掌楸 ＣＰＰ 转录因子家族 ＬｔＴＣＸ２ 基因的克隆与分析 １ ０ ０ １
全长ꎬ将全长序列于 ＮＣＢＩ 数据库中的 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｅｄｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ￣２. ０) 在 线 分 析
网站进行在线预测 ＯＲＦꎬ在起始密码子和终止密 蛋白 跨 膜 区、 扩 膜 方 向ꎻ 通 过 ＳＯＰＭＡ ( ｈｔｔｐｓ: / /
码子附近设计引物ꎬ验证 ＯＲＦ 的准确性ꎬ将完整的 ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ.ｉｂｃｐ. ｆｒ / ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ＿ａｕｔｏｍａｔ. ｐｌ? ｐａｇｅ ＝
ＯＲＦ 于 ＮＣＢＩ 数据库中的 ＢＬＡＳＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ 进行在线 ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ) 和 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ( ｈｔｔｐｓ: / / ｓｗｉｓｓ￣
功能比对ꎬ结合比对结果、其他物种的序列以及保 ｍｏｄｅｌ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / )在线预测分析蛋白的二级结构
守结构域ꎬ对目的基因进行命名ꎮ ＬｔＴＣＸ２ 基因全 和三 级 结 构ꎻ 通 过 在 线 软 件 ＳｉｇｎａｌＰ￣４. ０ Ｓｅｒｖｅｒ
长克隆实验中所用引物见表 １ꎮ (ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｃｂｓ. ｄｔｕ. ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＳｉｇｎａｌＰ￣４. ０ / ) 预
测蛋白的信号肽ꎻ通过 ＴａｒｇｅｔＰ１.１ Ｓｅｒｖｅｒ( ｈｔｔｐ: / /
表 １ ＬｔＴＣＸ２ 基因引物序列
ｗｗｗ.ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴａｒｇｅｔＰ / )和 ＷｏＬＦ ＰＳＯＲＴ
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ＬｔＴＣＸ２ ｇｅｎｅ
(ｈｔｔｐｓ: / / ｗｏｌｆｐｓｏｒｔ.ｈｇｃ.ｊｐ / )在线软件预测蛋白亚细
引物名称 引物序列
胞定位ꎻ通过 Ｍｏｔｉｆ Ｓｃａｎ( ｈｔｔｐｓ: / / ｍｙｈｉｔｓ.ｉｓｂ￣ｓｉｂ.ｃｈ /
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅｓ Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｍｏｔｉｆ＿ｓｃａｎ) 在线分析该蛋白的结构域ꎻ将
ＬｔＴＣＸ２ Ｆ１ ＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＣＣＣＴＣＴＧＴＴＣＴ
蛋白序列与 ＮＣＢＩ 网站进行 ＢＬＡＳＴ Ｐｒｏｔｅｉｎ 比对ꎬ
ＬｔＴＣＸ２ Ｒ１ ＡＣＣＣＴＴＣＡＣＡＴＣＴＧＣＡＡＴＴＡＣ
选择与之同源性较高的蛋白序列ꎬ通过 ＤＮＡＭＡＮ
ＬｔＴＣＸ２ Ｆ２ ＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＣＡＣ
软件ꎬ进行蛋白同源性比对分析ꎻ于 ＮＣＢＩ 上搜索
ＬｔＴＣＸ２ Ｒ２ ＡＴＧＴＡＴＧＧＧＧＧＡＴＧＴＴＡＧＴＣＧＴＣ
其他物种的同源序列ꎬ使用 ＭＥＧＡ７ 软件构建进化
３′ＲＡＣＥ Ｉｎｎｅｒ ＣＧＣＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＣＴＡＧＴＧＡＴＴＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧ
３′ＲＡＣＥ Ｏｕｔｅｒ ＴＡＣＣＧＴＣＧＴＴＣＣＡＣＴＡＧＡＧＡＴＴＴ 树(Ｋｕｍａｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００４)ꎮ
１.６ 实时荧光定量 ＰＣＲ 分析
３′ＲＡＣＥ ＧＳＰ１ ＧＡＴＴＡＣＴＧＡＡＧＣＣＣＡＡＡＡＧＧＡＴＧ
３′ＲＡＣＥ ＧＳＰ２ ＣＡＴＣＴＣＡＡＧＴＴＣＣＴＣＴＴＧＧＣＡＧＧＣＴＴＣ 以花芽、根、茎、叶、萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊的
５′ＲＡＣＥ ＵＰＭ ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＧＴＧ￣ ＲＮＡ 反转录后的 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ本实验室筛选出
ＧＴＡＴＣＡＡＣＧＣＡＧＡＧＴ
较稳定的 ＬｃＡｃｔｉｎ９７ 为内参引物ꎬＬｔＴＣＸ２ 基因引物
５′ＲＡＣＥ ＵＰＳ ＣＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＣ
５′ＲＡＣＥ ＧＰＳ１ ＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＡＴＣＴＣＣＣＣＴＧＣＡＡＣＴＣ 见表 ２ꎬ进行半定量 ＰＣＲ 反应( Ｔｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎮ
５′ＲＡＣＥ ＧＰＳ２ ＣＴＣＣＣＧＡＴＡＴＣＡＣＡＴＣＴＴＴＣＴＴ 荧光定量 ＰＣＲ 反应为 １０ μＬ 体系ꎬｃＤＮＡ 共 ５０ ｎｇꎬ
ＯＲＦ Ｆ ＡＧＧＣＧＡＴＣＧＡＧＡＴＧＧＡＣＡＣ 使用 ＡＢＩ 热循环仪ꎬ反应程序:９５ ℃ 预变性 １ ｍｉｎꎬ
ＯＲＦ Ｒ ＡＡＡＡＣＣＴＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＣＣＧ ９５ ℃ 变性 ５ ~ １０ ｓꎬ６０ ℃ 延伸 ３０ ~ ３４ ｓꎬ４０ 个循环ꎬ
Ａｃｔｉｎ９７ Ｆ ＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡＧＣＡＧＴＧＧＴＣＧ
１ 个溶解曲线 ９５ ℃ １５ ｓꎬ６０ ℃ １ ｍｉｎꎬ９５ ℃ １５ ｓꎮ
Ａｃｔｉｎ９７ Ｒ ＴＧＧＴＣＧＣＡＣＡＡＣＴＧＧＴＡＴＣＧ ￣ΔΔＣＴ
反应结果后ꎬ将数据导出ꎬ参照 ２ 法计算该基
ＲＴ￣ｑＰＣＲ Ｆ ＴＡＧＣＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＧＧＴＧＣＡＡ
因的相对表达量ꎬ使用 ＯＲＩＧＩＮ 软件绘制基因表
ＲＴ￣ｑＰＣＲ Ｒ ＡＡＧＧＣＴＣＡＡＣＡＣＡＧＴＡＧＡＣＡＣＣＡ
达图ꎮ
１.５ 生物信息学分析 ２ 结果与分析
将基 因 全 长 放 入 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ.
ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ. ｇｏｖ / ｏｒｆｆｉｎｄｅｒ / ) 在线分析预测开放阅 ２.１ 北美鹅掌楸组织总 ＲＮＡ 提取
读框 ＯＲＦꎬ确定基因编码蛋白序列ꎻ通过 ＥｘＰＡＳｙ 将北美鹅掌楸花芽、根、叶、茎、萼片、花瓣、雄
ＰｒｏｔＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / ｐｒｏｔｐａｒａｍ / ) 在 蕊、雌蕊共 ８ 个组织的总 ＲＮＡ 按照多糖多酚植物总
线分析蛋白质氨基酸组成、含量、分子量、等电点 ＲＮＡ 提取试剂盒(离心柱型) 提取 ＲＮＡꎮ 通过 １％
等 特 性ꎻ 通 过 ＰｒｏｔＳｃａｌｅ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ / 凝胶电泳检测 ＲＮＡ 完整性ꎬ发现 ２８Ｓ 和 １８Ｓ ｒＲＮＡ
ｐｒｏｔｓｃａｌｅ / )在线 软 件 分 析 蛋 白 疏 水 性 分 析ꎻ通 过 两条带亮度为 １.５ ~ ２ 倍ꎬ无明显弥散片状、条带消
ＥｘＰＡＳｙ ＴＭｐｒｅｄ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｃｈ. ｅｍｂｎｅｔ. ｏｒｇ / ｓｏｆｔ￣ 失现象ꎬ且 ＯＤ２６０ / ２８０、ＯＤ２６０ / ２３０ 比值处于 １.８ ~
ｗａｒｅ / ＴＭＰＲＥＤ ＿ ｆｏｒｍ. ｈｔｍｌ) 和 ＴＭＨＭＭ ( ｈｔｔｐｓ: / / ２.１ 之间ꎬ说明 ＲＮＡ 质量、完整性较好(图 １)ꎮ
