Page 106 - 《广西植物》2020年第7期

１ ０ ０ ２ 广 西 植 物 ４０ 卷

图 １ 北美鹅掌楸 ８ 个组织总 ＲＮＡ 提取完整性检测
Ｆｉｇ. １ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｉｎ ｅｉｇｈｔ ｐａｒｔｓ ｆｒｏｍ Ｌｉｒｉｏｄｅｎｄｒｏｎ ｔｕｌｉｐｉｆｅｒａ

２.２ 北美鹅掌楸 ＬｔＴＣＸ２ 基因克隆 ＬｔＴＣＸ２ 基因片段过长ꎬ将其中间片段分为两部分
从北美鹅掌楸转录数据库中筛选 １ 个 ＣＰＰ￣ 依次扩增ꎮ 通过 ＮＣＢＩ 网站进行 ＯＲＦ 验证ꎬ设计
ｌｉｋｅ 家族 ｕｎｉｇｅｎｅꎬ总长度 ３ １７４ ｂｐꎬ通过设计引物 引物 验 证 ＯＲＦ 序 列 的 准 确 性 ( 图 ２ )ꎮ 最 终ꎬ
依次进行中间片段扩增、３′ＲＡＣＥ 扩增、５′ＲＡＣＥ 扩 ＬｔＴＣＸ２ 基因全长 ２ ８６６ ｂｐꎬＯＲＦ 为 ２ ４２４ ｂｐꎬ编码
增ꎬ回收产物进行连接转化ꎬ挑选阳性克隆送至公 了 ８０７ 个 氨 基 酸ꎬ ５′ ＵＴＲ 长 ２２８ ｂｐꎬ ３′ ＵＴＲ 长
司 测 序ꎬ 拼 接 出 目 的 基 因 的 完 整 序 列ꎮ 鉴 于 ２１４ ｂｐꎮ

Ｍ. ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ａꎬ Ｂ. 中间片段扩增ꎻ Ｃ. ３′ＲＡＣＥ 扩增ꎻ Ｄ. ５′ＲＡＣＥ 扩增ꎻ Ｅ. ＯＲＦ 验证ꎮ
Ｍ. ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎻ Ａꎬ Ｂ. Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＰＣＲꎻ Ｃ. ３′ ＲＡＣＥ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＰＣＲꎻ Ｄ. ５′ ＲＡＣＥ ｆｒａｇｍｅｎｔ ＰＣＲꎻ Ｅ. ＯＲＦ ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ.
图 ２ ＬｔＴＣＸ２ 基因克隆电泳图
Ｆｉｇ. ２ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ ＬｔＴＣＸ２ ｇｅｎｅ

２.３ 北美鹅掌楸 ＬｔＴＣＸ２ 基因生物信息学分析 Ｍｏｔｉｆ Ｓｃａｎ 在线分析 ＬｔＴＣＸ２ 蛋白的结构域ꎬ含有 ２
２.３. １ 蛋 白 理 化 性 质 及 跨 膜 区 预 测 分 析 将 个 ＴＳＯ１￣ｌｉｋｅ ＣＸＣ 结 构 域ꎬ 分 别 位 于 ５０４ ~ ５４５、
ＬｔＴＣＸ２ 基因序列放入 ＮＣＢＩ 在线软件进行 ＯＲＦ 预 ５９０ ~ ６３１ ａａ(图 ３)ꎮ

测ꎬ确定基因编码的蛋白序列ꎮ 结果显示ꎬＬｔＴＣＸ２ 将 ＯＲＦ 编 码 的 蛋 白 序 列 通 过 ＥｘＰＡＳｙ
基因的 ＯＲＦ 长 ２ ４２４ ｂｐꎬ编码了 ８０７ 个氨基酸ꎬ以 ＰｒｏｔＰａｒａｍ 在线分析氨基酸组成、含量、分子量等ꎮ
ＡＴＧ 为 起 始 密 码 子ꎬ ＴＧＡ 为 终 止 密 码 子ꎮ 通 过 ＬｔＴＣＸ２ 蛋白总分子式为 Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ分
３８１９ ６０８４ １０９６ １２５６ ３９