Page 41 - 《广西植物》2020年第7期
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７ 期                       张晓宁等: 无菌马尾松种子超低温保存技术研究                                           ９ ３ ７

   ２０１９)、黑杨(Ｍａｒｃｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)、合欢和青杄(河             １.１.１ 发芽率的测定  将待测种子播种于含双层
   英虎等ꎬ２０１３)、 高 山 栲 ( 卢 玲 等ꎬ２０１３)、 红 豆 杉             滤纸的培养皿ꎬ定期喷水ꎬ保持滤纸湿润ꎮ 光照培
   (程利红 等ꎬ２０１２)ꎮ 孙 鸿 有 等 ( １９９４) 的 研 究 认             养箱 ２７ ℃ 黑暗培养 ５ ｄꎻ 第 ６ 天开始ꎬ光照强度
   为ꎬ马尾松种子最适保存温度是－１８ ~ －１５ ℃ ꎮ 喻                     ２ ０００ ｌｘꎬ光照时间 ８ ｈｄ ꎮ 当根长等于种子长时
                                                                             ￣１
   方圆等(２００６ａ)研究认为ꎬ种子在－３０ ℃ 储藏初期                      记为发芽ꎮ 发芽率 ＝ ( 发芽种子数 / 种子总数) ×

   发芽率就开始大幅下降ꎮ 谭俊(２００９) 研究认为ꎬ                        １００％ꎮ ４ 个重复ꎬ每重复 １００ 粒ꎮ
   从种子的安全贮藏来看ꎬ马尾松种子不适合在－２５                           １.１.２ 初始含水量( ω ) 的测定  采用低温烘干法
                                                                        ０
   ℃ 及以下的温度贮藏ꎮ 喻方圆等(２００６ｂ) 利用差                       (１０３ ℃ 烘干 １６ ｈ) 测定ꎬω ＝ ( 鲜重－绝干重) / 鲜
                                                                              ０
   式扫描量热仪证明ꎬ马尾松种子在－２４.８２６ ℃ 的温                       重×１００％ꎮ ３ 个重复ꎬ每重复 ５０ ｇꎮ
   度下结晶ꎬ细胞质中粗脂肪含量高ꎬ低聚糖与蔗糖                            １.１.３ 含水梯度的获取  消毒后的种子采用浸种
   比值低ꎬ决定了其难形成玻璃化状态ꎬ并推测这是                            和硅胶干燥的方式获取 ２７.４３％ ~ ３.２％的 １０ 个含
   马尾松种子不耐－３０ ℃ 以下储藏的主要原因ꎮ                           水量梯度的种子ꎬ密闭于双层铝箔袋中 ４ ℃ 保存
       杨学军(２００８)首次利用脱水干燥法将马尾松                        备用ꎮ 实 际 含 水 量 ( ω ) 采 用 减 重 法 计 算ꎬ ω ＝
                                                                           １                     １
   种子进行了超低温保存ꎬ当含水量为 ４.３％ 时ꎬ获                         １００％－[最初重量 ×(１００％ －相对含水量)] / 最后
   得 ８０％的发芽率ꎬ但主要针对含水量和冷冻保护                           重量ꎮ (消毒方式:流水冲洗 ２ ｈꎬ０.５％ ＫＭＮＯ 浸
                                                                                                ４
   剂对超低温保存效果的影响进行了研究ꎮ 本研究                            泡 ０.５ ｈꎬ无菌水冲洗 ６ 次ꎬ０.１％升汞消毒 ５ ｍｉｎꎬ
   在此基础上ꎬ以无菌种子为材料ꎬ系统研究了含水                            无菌水冲洗 ６ 次ꎮ)
   量、冷冻方式、化冻方式及种皮的保护作用等对冻                            １.２ 种子的超低温保存试验
   存效果的影响ꎬ简化了马尾松种子超低温保存技                             １.２.１ 不同含水量对冻存后发芽率的影响  先取
   术体系ꎬ提高了保存效率ꎬ确定了最适含水量和安                            含水量分别为 ３.２％、４.８％、６.１％、７.５％、１０.７％、
   全含水范围ꎬ并首次指出超低温保存对马尾松种                             １５.８％、１６.８％、２２.７％、２４.６％、２７.４％ 的马尾松种
   子具有一定“ 刺激” 作用ꎬ进一步验证马尾松种子                          子装于 １.８ ｍＬ 冷冻管中直接投入液氮保存 ２４ ｈ
   超低温保存的可行性ꎮ 这对马尾松种子资源长期                            后ꎬ室温自然化冻ꎬ随后将种子播于铺有三层无菌
   保存提供了理论指导和技术支撑ꎬ为其他林木种                             滤纸的培养皿中ꎬ封口ꎬ置于光照培养箱进行发芽
   子的超低温保存研究提供参考ꎮ 本研究利用无菌                            试验ꎬ并测定冻存后发芽率ꎮ

   种子不仅消除了种子发霉对发芽率的干扰和影响ꎬ                            １.２.２ 冷冻方式对冻存后发芽率的影响  取含水
   而且还可直接获得无菌幼苗用于后续研究ꎮ                               量为 ３. ２％、４. ８％、６. １％、１０. ７％、１６. ８％、２２. ７％、
                                                     ２７.４％的 ７ 个梯度的种子装于冷冻管中进行如下
   １  材料与方法                                          操作:(１)快冻法:直接投入液氮ꎻ(２) 缓冻法:经－
                                                     ２０ ℃ 预冻 ３０ ｍｉｎ 投入液氮ꎻ(３)慢冻法:经－２０ ℃
   １.１ 种子质量特性的测定及含水梯度的建立                             低温预处理 ２４ ｈ 后投入液氮ꎮ 三种冷冻方式统一
       试验用马尾松种子于 ２０１７ 年 １１ 月采自广西                     在液氮保存 ２４ ｈ 后ꎬ室温自然化冻ꎬ统计发芽率ꎮ
   藤县ꎮ 试验用干燥箱:上海施都凯ꎬＢＡＯ￣１５０Ａꎻ超                       １.２.３ 化冻方式对冻存后发芽率的影响  先将上

   净工作台:苏州净化 ＳＷ￣ＣＪ￣２Ｄꎻ光照培养箱:杭州                       述 ７ 个含水量梯度的种子直接投入液氮ꎬ冻存后
   汇尔 ＧＺＨ￣０１５８ꎻ冷冻管:美国 Ｎｕｎｃꎻ硅胶:上海新                    的材料从液氮中取出ꎬ设置室温空气化冻、４２ ℃ 水
   火ꎻＫＭｎＯ :郑州中天实验仪器有限公司ꎻ升汞:贵                         浴化冻两种化冻方式各 ５ ｍｉｎ 后ꎬ 再将种子播于
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   州省铜仁化工研究所ꎮ                                        铺有三层无菌滤纸的培养皿ꎬ封口ꎬ置于光照培养
       参照«林木种子检验规程» ( 国家质量技术监                        箱黑暗培养ꎬ记录冻存后发芽率ꎮ
   督局ꎬ２０００) 要求测定千粒重、初始含水量和发芽                         １.２.４ 种皮对冻存后发芽率的影响  取含水量为
   率等种子质量特性ꎮ                                         ２７.４％、１０.７％、６.１％ 和 ３.２％的种子ꎬ剥去种皮ꎬ装
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