Page 134 - 《广西植物》2020年第5期

７ ３ ０ 广 西 植 物 ４０ 卷
恒科技有限公司)ꎬＢＳＡ１２４Ｓ 分析天平(德国赛多利 重计算产量ꎬ样品备用ꎮ
斯集团)ꎬＳＷ￣ＣＪ￣２ＦＤ 洁净工作台( 中国苏州安泰 １.５.３.２ 生物活性检测 病原指示菌分别接种至液
ＡＩＲＴＥＣＨ 公司)ꎬＥＳ￣３１５ 高压蒸汽灭菌锅( ＴＯＭＹꎬ 体 ＬＢ 培养基ꎬ白色念珠菌于 ２８ ℃ ꎬ其余病原细菌
日本)ꎬＤＨＧ￣９２４０Ａ 电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒 于 ３７ ℃ ꎬ２２０ ｒｍｉｎ 震荡培养 １８ ｈꎮ 用 ＬＢ 液体
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科技有限公司)ꎬＬＲＨ￣２５０ 生化培养箱(上海一恒科 培养基分别对各指示菌菌液进行梯度稀释ꎬ稀释
６ ７ ￣１
技有限公司)ꎬＳＫ５２００Ｈ 超声仪(上海科导)ꎮ 至浓度为 １× １０ ~ １×１０ 个ｍＬ ꎮ
１.５ 方法 采用牛津杯法测定各菌株不同发酵粗提物的
１.５.１ 内生菌优势菌株的筛选 放线菌在 ＹＭＧ 培 体外抗菌活性ꎬ指示菌用涂布法或混菌法准备ꎮ

养基上培养 ４ ｄꎬ用含菌的琼脂块扩散法进行放线 每个粗提物用 ４ ｍＬ 丙酮溶解ꎬ分别取 ５０ μＬ 进行
菌抗病原细菌活性筛选ꎻ用平板对峙法进行抗真 活性测定ꎬ取 ５０ μＬ ＬＢ 培养基做阴性对照ꎬ取 ５０
菌活性筛选ꎻ用 ＳＲＢ 法测定菌株的细胞毒性ꎮ 分 μＬ 丙酮做空白对照ꎬ取等体积抗生素溶液做阳性
别用 Ａ３Ｆ / Ａ７Ｒ(７００ ~ ８００ ｂｐ)、Ｋ１Ｆ / Ｍ６Ｒ(１ ２００ ~ 对照(病原细菌以 ５ μｇ 利福霉素为阳性对照ꎻ白
１ ４００ ｂｐ)、ＫｓａＦ / ＫＳａＲ (６１３ ｂｐ) 引物进行 ＰＣＲ 筛 色念珠菌用 ２０ μｇ 氟康唑为阳性对照)ꎮ 白色念

选非核糖体肽合成酶 ＮＲＰＳ 基因及聚酮合酶 ＰＫＳ￣Ｉ、 珠菌于 ２８ ℃ 培养ꎬ其余病原细菌于 ３７ ℃ 培养ꎬ２４
ＰＫＳ￣Ⅱ基因(Ｑｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００９)ꎮ ｈ 后用游标卡尺测量抑菌圈的直径大小ꎮ
１.５.２ 优势菌株的分类分析 对筛选出的阳性菌 采用 ＭＴＴ 法对部分发酵产物进行抗肿瘤活性

株进行基因组提取ꎬ 利用细菌 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因通 测试ꎮ 粗筛浓度为 ２０ μｇｍＬ ꎬ 加样 ７２ ｈ 后观
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用引物 ＰＡ: ５′￣ＣＡＧ ＡＧＴ ＴＴＧ ＡＴＣ ＣＴＧ ＧＣＴ￣３′ꎬ 察肿瘤细胞生长状况ꎮ
ＰＢ: ５′￣ＡＧＧ ＡＧＧ ＴＧＡ ＴＣＣ ＡＧＣ ＣＧＣ Ａ￣３′ 进 行
ＰＣＲ 扩增ꎮ 扩增条件:９４ ℃ 预变性 ５ ｍｉｎꎻ３０ 个循 ２ 结果与分析
环(９４ ℃ 变性 １ ｍｉｎꎬ５６ ℃ 退火 １ ｍｉｎ) ꎬ７２ ℃ 延伸
３ ｍｉｎꎻ７２ ℃ 总延伸 ６ ｍｉｎꎮ 得到的 ＰＣＲ 产物经 ２.１ 内生菌优势菌株的筛选
０.８％琼脂糖胶回收后送生工生物工程 ( 上海) 股 对 ３００ 余株分离自剑叶龙血树的内生放线菌

份 有 限 公 司 测 序ꎬ 得 到 的 序 列 经 ＥｚＢｉｏＣｌｏｕｄ 进行抗病原细菌、抗病原真菌活性、抗肿瘤细胞活
(ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ. ｅｚｂｉｏｃｌｏｕｄ. ｎｅｔ/ ) 中 的 ＥｚＴａｘｏｎ 在 线 性以及 ＰＫＳ￣Ｉ、ＰＫＳ￣Ⅱ和 ＮＲＰＳ 基因的研究ꎬ拟筛选
比对服务进行相关标准菌株的相似性搜索ꎬ确定 出兼具多种抗菌活性和肿瘤细胞毒活性ꎬ并具有

菌 株 的 分 类 学 地 位ꎬ 并 调 出 相 关 放 线 菌 的 产聚酮类化合物和非核糖体多肽类化合物潜力的
１６Ｓ ｒＲＮＡ基因序列ꎬ随后用 Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ 进行序列比 菌株ꎮ 筛选结果表明ꎬ五株内生放线菌 Ｓ０１ －Ｓ０５
对ꎬ最终用 ＭＥＧＡ ６ 软件 Ｎｅｉｇｈｂｏｕｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇ 法构建 整体结果较好ꎬ对初筛的 ６ 种以上病原细菌表现
系统发育树ꎮ 出显著抑菌活性ꎬ菌株 Ｓ０２ 和 Ｓ０４ 对 ８ 种病原细菌
１.５.３ 优势菌株产活性代谢产物发酵培养基的优化 的抑制作用较好ꎬ抑菌圈直径最高达 ３８ ｍｍꎮ ５ 株
１.５.３. １ 菌 株 发 酵 及 提 取 内 生 放 线 菌 接 种 于 菌对产毒真菌和肿瘤细胞株的活性以及次级代谢
ＹＭＧ 培养基平板上ꎬ２８ ℃ 恒温培养箱倒置培养 相关基因簇筛选的结果如表 １ 所示ꎬＳ０１、 Ｓ０２ 和
３ ~ ４ ｄ 做为菌种ꎬ挑取适量菌丝分别接于 Ａ－Ｈ 培 Ｓ０５ 同时对三株产毒真菌均有抗菌活性ꎻＳ０１ 和

养基 (２５ ｍＬｐｌａｔｅ )ꎬ每株 菌 每 种 培 养 基 发 酵 Ｓ０２ 中 ＰＫＳ￣Ｉ、ＰＫＳ￣Ⅱ和 ＮＲＰＳ 三种基因均为阳性ꎻ
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１００ ｍＬꎬ于 ２８ ℃ 恒温培养箱倒置培养ꎬ１４ ｄ 后将 Ｓ０２ 发酵液粗提物对 Ｈｅｐ Ｇ２ 和 ＭＣＦ￣７ 细胞株有
琼脂切块于三角烧瓶中ꎬ用乙酸乙酯 ∶ 甲醇 ∶ 冰 显著抑制活性ꎬＩＣ 值分别为 １０ 和 ３ μｇｍＬ ꎮ
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５０
乙酸 (８０ ∶ １５ ∶ ５) 浸泡过夜提取三遍ꎬ把琼脂过 ２.２ 优势菌株 １６Ｓ ｒＤＮＡ 序列扩增及系统发育学分析
滤后在旋转蒸发仪上减压浓缩回收溶剂ꎬ用有机 对初筛出的 ５ 株优势菌株提取基因组后进行
溶剂将粗提物转至样品瓶ꎬ等溶剂完全挥发后ꎬ称 １６Ｓ ｒＲＮＡ 基因测序ꎬ 将所得序列在数据库中进行