Page 107 - 《广西植物》2023年第11期

１１ 期 吴诗琪等: 西南地区野生刺梨的遗传多样性和遗传结构研究 ２ ０ ６ ７

单拷贝基因( ｓｃｎＤＮＡ) 是双亲遗传ꎬ携带大量 ９.５ μＬꎮ 扩增后得到的 ＰＣＲ 产物经 ２％的凝胶电
的遗传信息ꎬ属于直系同源ꎬ可以更好地反映物种 泳检测后将凝胶成像系统上有清晰、明亮条带的
的进化史( 毕毓芳等ꎬ２０１９)ꎮ 近年来叶绿体基因 样品送往北京擎科生物科技有限公司( 重庆分公

(ｃｐＤＮＡ)逐渐受到广泛应用ꎬ其特点是分子量小、 司)进行纯化及测序ꎮ
序列较为保守、进化迟缓、结构单一、单亲遗传ꎬ并 对于单拷贝核基因 ｎｃｐＧＳ 序列所使用的反应

且不易受外界环境影响(樊守金和郭秀秀ꎬ２０２２)ꎬ 程序:预变性 ９４ ℃ ５ ｍｉｎꎬ变性 ９５ ℃ ４５ ｓꎬ退火 ５１
可以用来揭示物种应对环境变化的进化潜力ꎬ对 ℃ ４５ ｓꎬ延伸 ７２ ℃ ２ ｍｉｎꎬ循环 ３４ 次ꎬ最后延伸 ７２
其遗传多样性的保护以及保护计划的制订实施都 ℃ １０ ｍｉｎꎬ１２ ℃ 恒温保存ꎮ ＧＡＰＤＨ 序列所使用的
具有非常重要的价值( 刘海瑞等ꎬ２０１８)ꎮ 将二者 反应条件:预变性 ９４ ℃ ４ ｍｉｎꎬ变性 ９５ ℃ ５０ ｓꎬ退

结合分析可以更好地开展物种遗传多样性研究ꎬ 火 ５７ ℃ ５０ ｓꎬ延伸 ７２ ℃ ２ ｍｉｎꎬ循环 ３４ 次ꎬ最后延
使结果更加准确ꎮ 伸 ７２ ℃ １０ ｍｉｎꎬ１２ ℃ 恒温保存ꎮ 对于叶绿体基因
本研究 采 用 ２ 个 单 拷 贝 核 基 因 ( ＧＡＰＤＨ 和 ａｔｐＦ－ｔｒｎＨ 序列所使用的反应程序:预变性 ９４ ℃ ５
ｎｃｐＧＳ)和进化速率较快的 ３ 个叶绿体基因间隔区 ｍｉｎꎬ变性 ９４ ℃ ５０ ｓꎬ退火 ５５ ℃ ５０ ｓꎬ延伸 ７２ ℃ １
ａｔｐＦ－ｔｒｎＨ、ｔｒｎＬ－ｔｒｎＦ 和 ｔｒｎＧ－ｔｒｎＳ 序列结合对分布 ｍｉｎꎬ循环 ３４ 次ꎬ最后延伸 ７２ ℃ １０ ｍｉｎꎬ１２ ℃ 恒温
西南地区的 ５ 个省市ꎬ２７ 个居群共 ３２０ 个野生刺 保存ꎮ ｔｒｎＬ－ｔｒｎＦ 序列所使用的反应条件:预变性
梨材料进行分析ꎮ 采用群体遗传学和谱系地理学 ９６ ℃ ５ ｍｉｎꎬ变性 ９４ ℃ ４０ ｓꎬ退火 ５４ ℃ ４０ ｓꎬ延伸
的研究方法ꎬ探讨野生刺梨居群遗传多样性和遗 ７２ ℃ １ ｍｉｎꎬ循环 ３５ 次ꎬ最后延伸 ７２ ℃ １０ ｍｉｎꎬ１２
传格局ꎬ种群历史动态ꎬ并探究野生刺梨的起源演 ℃ 恒温保存ꎮ ｔｒｎＧ－ｔｒｎＳ 序列所使用的反应程序:
化历史进程ꎬ为刺梨的资源保护和遗传育种提供 预变性 ８５ ℃ ５ ｍｉｎꎬ变性 ９５ ℃ １ ｍｉｎꎬ退火 ５４ ℃ １
科学参考资料ꎮ 同时ꎬ也为西南地区植物区系演 ｍｉｎꎬ延伸 ７２ ℃ ２ ｍｉｎꎬ循环 ３４ 次ꎬ最后延伸 ７２ ℃
化和物种形成机制研究奠定一定的基础ꎮ １０ ｍｉｎꎬ１２ ℃ 恒温保存ꎮ
１.３ 数据处理与分析
１ 材料与方法 获得测序结果后ꎬ用 Ｍｅｇａ ６ 软件( Ｔａｍｕｒａ ｅｔ

ａｌ.ꎬ ２０１３)删掉序列两端不可靠的碱基序列后进
１.１ 实验材料 行比对ꎬ使用 ＢｉｏＥｄｉｔ 软件( Ａｈｍｅｄꎬ ２０１１) 查看测
本研究的 ３２０ 个刺梨材料采自贵州省、四川 序峰图ꎬ将序列进行手工校正得到比对好的数据
省、云南省、重庆市和湖北省共 ５ 个省市ꎬ覆盖了 后ꎬ利用 ＰｈｙｌｏＳｕｉｔｅ 软件( Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０) 将两
整个西南地区的 ２７ 个自然居群(表 １)ꎮ 根据当地 个单拷贝核基因以及 ３ 个 ｃｐＤＮＡ 片段分别拼接成
的分布规模决定居群的样本数量ꎬ每个居群采样 一个整体的长片段ꎮ 采用 ＤｎａＳＰ ６ 软件( Ｒｏｚａｓ ｅｔ

５ ~ １８ 个不等ꎬ单个样本间距离 ５０ ｍ 以上( 图 １)ꎮ ａｌ.ꎬ ２０１７) 对 ２７ 个刺梨居群进行 ＤＮＡ 多态性分
每株采取新鲜幼嫩的叶片 １０ ~ ２０ ｇꎬ将采集好的叶 析ꎬ得到相关所示数据ꎬ如单倍型数量( Ｈ)、单倍
片就地迅速保存于采集袋中ꎬ加入硅胶进行干燥 型多 样 性 ( Ｈｄ)、 核 苷 酸 多 样 性 ( π)、 变 异 位 点
保存ꎬ后用于 ＤＮＡ 提取ꎮ 所采集的凭证标本存放 (Ｖｓ)、简约 信 息 位 点 ( Ｐｓ)ꎮ 进 行 中 性 检 验 得 到

于贵州大学生命科学学院中ꎮ Ｔａｊｉｍａｓ Ｄ 值和 Ｆｕｓ Ｆｓ 值ꎬ看结果是否符合中性进
１.２ ＤＮＡ 提取、ＰＣＲ 扩增及测序 化模型ꎬ从而判断是否曾经发生过扩张现象ꎻ以及
采用天根生化科技(北京) 有限公司的植物基 进行错配分析ꎬ观察曲线进一步分析居群是否经
因组 ＤＮＡ 试剂盒( ＤＰ３０５) 提取刺梨 ＤＮＡꎮ 利用 历过 扩 张 或 瓶 颈 效 应 ( 张 晓 芸 等ꎬ ２０１９ )ꎮ 用
２％琼脂糖凝胶电泳检测 ＤＮＡ 是否提取成功ꎮ ３ ＰＥＲＭＵＴＣｐＳＳＲ 软件(Ｃａｒａｕｘ ＆ Ｐｉｎｌｏｃｈｅꎬ ２００５) 计
段叶绿体基因序列( ａｔｐＦ－ｔｒｎＨ、ｔｒｎＬ－ｔｒｎＦ 和 ｔｒｎＧ－ 算遗 传 分 化 系 数 Ｎ 和 Ｇ ꎮ 利 用 Ａｒｌｅｑｕｉｎ 软 件
ＳＴ ＳＴ
ｔｒｎＳ)和 ２ 段单拷贝核基因( ＧＡＰＤＨ 和 ｎｃｐＧＳ) 分 (Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ ＆ Ｌｉｓｃｈｅｒꎬ ２０１０) 进 行 分 子 方 差 分 析
别通过 ５ 段引物进行 ＰＣＲ 扩增(表 ２)ꎮ ＰＣＲ 扩增 (ＡＭＯＶＡ)ꎬ计算刺梨居群内 和 居 群 间 的 遗 传 变
反应为 ２５ μＬ 体系:２ × Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １２. ５ 异ꎬ并计算遗传分化系数( Ｆ ) 揭示群体间遗传结
ＳＴ
μＬꎻ上游引物、下游引物和 ＤＮＡ 各 １ μＬꎻｄｄ Ｈ ０ 构ꎬ 基因流(Ｎｍ)进一步表明居群的分化水平ꎮ 利
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