Page 60 - 《广西植物》2024年第2期

２ ６ ２ 广 西 植 物 ４４ 卷
水性蛋白ꎬ与郑雪文等 (２０２１) 的研究结果一致ꎮ
在 ＨｍＡＰ３ 蛋白三级结构模型中ꎬＫ￣ＢＯＸ 形成长
α￣螺旋结构ꎬ与植物 ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ 家族中 Ｋ￣ＢＯＸ 结
构域特征一致ꎬ该结构在 ＡＰ３ 与其他蛋白结合形

成四聚体的过程中发挥关键作用 ( Ｙａｎｇ ＆ Ｊａｃｋꎬ
２００４)ꎮ
ＨｍＡＰ３ 蛋白系统进化树表明 ＡＰ３ 基因在植

物系统进化过程中的保守性ꎬ其中绣球与金鱼草、
烟草和番茄 ＡＰ３ 基因聚类在同一大分支ꎬ亲缘关

系 较 近ꎬ 与 Ｖｉａｅｎｅ 等 ( ２００９ ) 研 究 结 果 相 似ꎮ
Ｍａｒｔｉｎｏ 等 (２００６) 和 Ｌｉｕ 等 (２００４) 研究发现ꎬ番
茄 ＳｌＡＰ３ 与烟草 ＮｔＡＰ３ 基因沉默后代表现出花萼
轮数增多、花瓣消失的性状ꎮ 通过同源比对ꎬ推测
绣球 ‘ 杜 丽’ ＨｍＡＰ３ 基 因 与 其 同 源 基 因 ＳｌＡＰ３、
ＮｔＡＰ３ 功能相似ꎬ可能负责调控绣球花器官中花萼
和花瓣的形成ꎮ
本研究构建了 ２ 个绣球 ＨｍＡＰ３ 单靶点载体ꎬ
并在转化获得的抗性芽基因组中检测到载体序
列ꎬ但在抗性芽中未检测到 Ｃａｓ９ 序列的表达和编
图 ２ ＨｍＡＰ３ 蛋白三级结构 辑位点序列突变ꎮ 本研究与 Ｒｅｎ 等 (２０１３) 的研
Ｆｉｇ. ２ Ｔｅｒｔｉａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ＨｍＡＰ３ ｐｒｏｔｅｉｎ 究结果相似ꎬ他推测基因编辑效率与启动子活性
有关ꎬ当 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因编辑载体中的启动子
分 别 使 用 靶 基 因 序 列 扩 增 引 物 ＨｍＡＰ３￣Ｆ１ / 从 ｎｏｓ￣ｍｉｎｉ 变为 Ｕ６ｂ 启动子时ꎬ遗传突变率可从 ０
提高 至 ３. ２％ꎮ 在 观 赏 植 物 中ꎬ Ｋｉｓｈｉ￣Ｋａｂｏｓｈｉ 等
ＨｍＡＰ３￣Ｒ１ 和 Ｃａｓ９ 序列扩增引物 Ｃａｓ９￣Ｆ / Ｃａｓ９￣Ｒ
对抗性芽进行鉴定ꎮ 扩增和测序结果表明ꎬ９ 株抗 (２０１９) 的研究也佐证了这一观点ꎬ系统性比较了
性芽叶片基因组中有 ５ 株可克隆到 Ｃａｓ９ 序列ꎬ但 Ｕｂｉｑｕｔｉｎ、ＣａＭＶ ３５Ｓ 和 ＣｍＡｃｔｉｎ２ 启动子的表达活
其靶点序列均未发生突变 (图 ６:Ｂ)ꎮ 提取抗性芽 性差异后ꎬ发现 ＣａＭＶ ３５Ｓ 和 Ｕｂｉｑｕｔｉｎ 启动子在菊
叶片总 ＲＮＡ 后反转录获得 ｃＤＮＡꎬ再次克隆 Ｃａｓ９ 花愈伤组织中活性均低于菊花 ＣｍＡｃｔｉｎ２ 启动子ꎮ
序列ꎬ发现所有样品均无法扩增出条带ꎮ 该现象 本研究使用的 Ｃａｓ９ 序列启动子为 Ｕｂｉｑｕｔｉｎ 启动
子ꎬ猜想其在绣球组织中的表达活性极低ꎬ导致
说明虽然载体序列已成功整合到载体基因组上ꎬ
但是 Ｃａｓ９ 蛋白并未成功转录和表达ꎬ因此ꎬ编辑靶 Ｃａｓ９ 序列在抗性芽中未表达ꎮ 在下一步绣球基因
编辑工作中ꎬ可将载体中启动子更换为绣球本源
点的序列没有改变ꎮ
启动子ꎬ进一步探究启动子活性对基因编辑成功
３ 讨论与结论 率的影响ꎮ
本研究发现绣球对潮霉素的高敏感性也是影
本研究克隆了绣球‘ 杜丽’ 的 ＨｍＡＰ３ 基因ꎬ并 响 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因编辑效率的重要因素ꎮ 本研
对其核苷酸序列与氨基酸序列进行了生物信息学 究使用 ２ ｍｇＬ 潮霉素浓度对绣球抗性芽进行筛
￣１
分析ꎮ 研 究 发 现 ＨｍＡＰ３ 与 模 式 植 物 拟 南 芥 选ꎬ再生率仅为 ０.４５％ꎬ与苹果 ( 贾东杰等ꎬ２０１３)

(Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００３) 及园艺作物绿竹 ( 朱龙飞ꎬ 等在潮霉素筛选下的再生情况相符ꎬ推测绣球野
２０１３)、葡萄 (胡晓燕等ꎬ２０２１)、菠萝 ( 郑雪文等ꎬ 生型基因组内不含有潮霉素抗性基因ꎮ 甘煌灿等
２０２１) 在特有的 Ｋ￣ＢＯＸ 结构域上长度相近、结构 (２０１８) 提出可通过在再生筛选过程中逐渐增加
相似ꎬ表明此结构域在不同物种的 ＡＰ３ 中高度保 潮霉素浓度的方法ꎬ提高抗性芽的成活率ꎮ 后续
守ꎮ 理化性质分析结果表明 ＨｍＡＰ３ 是稳定的亲 的绣球抗性芽的筛选条件可通过调整不同再生阶