Page 57 - 《广西植物》2024年第2期
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２ 期 李童等: 绣球‘杜丽’ＡＰ３ 基因克隆与基因编辑载体构建 ２ ５ ９
２０１３)等发生从花瓣向花萼的同源异型转变ꎮ 股份有限公司) 进行质粒提取和测序工作ꎬ获得
因此ꎬ本研究对绣球‘杜丽’的 ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ Ｂ 类 ＨｍＡＰ３ 基因的 ＣＤＳ 序列ꎮ
基因 ＨｍＡＰ３ 进行了克隆和生物信息学分析ꎻ同时 １.３ 绣球‘杜丽’ＨｍＡＰ３ 基因生物信息学分析
结合组内前期绣球‘ 杜丽’ 再生体系建立基础ꎬ借 使用 Ｃｅｌｌ￣ＰＬｏｃ (ｈｔｔｐ:/ / ｗｗｗ.ｃｓｂｉｏ.ｓｊｔｕ.ｅｄｕ.ｃｎ /
助 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基 因 编 辑 系 统ꎬ 构 建 了 ２ 个 ｂｉｏｉｎｆ/ Ｃｅｌｌ￣ＰＬｏｃ￣２/ ) 对 ＨｍＡＰ３ 进行亚细胞定位预
ＨｍＡＰ３ 单靶点载体ꎬ转化获得抗性芽ꎬ拟探讨以下 测 ( Ｃｈｏｕ ＆ Ｓｈｅｎꎬ ２０１０ )ꎮ 利 用 ＮＣＢＩ￣ＢＬＡＳＴ
问题:(１) ＨｍＡＰ３ 氨基酸序列保守结构域特征与 (ｈｔｔｐｓ:/ / ｂｌａｓｔ. ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ / Ｂｌａｓｔ. ｃｇｉ ) 比 对
蛋白结构分析ꎻ(２) ＨｍＡＰ３ 系统进化关系及其生 ＨｍＡＰ３ 氨基酸序列相似性ꎬ下载比对结果中排名在
物学功能预测ꎻ(３) 探究影响绣球 ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 前列的其他植物 ＡＰ３ 氨基酸序列ꎬ同时下载拟南芥
基因编辑工作成功率的因素ꎮ 以期为绣球的性状 ＡｔＡＰ３ 氨基酸序列ꎬ通过 ＭＥＧＡ￣Ｘ 软件的邻接法
改良 和 新 品 种 繁 育 工 作 提 供 实 践 参 考 和 技 术 (ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄꎬ ＮＪ) 构 建 系 统 进 化 树
支撑ꎮ (Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９)ꎮ 利用 ＭＥＭＥ ( ｈｔｔｐ:/ / ｍｅｍｅ￣
ｓｕｉｔｅ.ｏｒｇ / ｔｏｏｌｓ/ ｍｅｍｅ / ) 预测 ＨｍＡＰ３ 氨基酸序列保
１ 材料与方法 守基序ꎮ 通过 ＰｒｏｒＰａｒａｍ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｗｅｂ. ｅｘｐａｓｙ. ｏｒｇ /
ｐｒｏｔｐａｒａｍ/ ) 分析 ＨｍＡＰ３ 蛋白的理化性质 ( Ｌｉ ｅｔ
１.１ 试验材料和试剂 ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎮ 分 别 使 用 蛋 白 二 级 结 构 预 测 工 具
绣球‘杜丽’种植于北京植物园 (１１６° ２８′ Ｅ、 ＳＯＰＭＡ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｎｐｓａ￣ｐｒａｂｉ. ｉｂｃｐ. ｆｒ/ ｃｇｉ￣ｂｉｎ / ｎｐｓａ ＿
４０°００′ Ｎ)ꎮ 于 ４ 月选取翠绿、无病虫害的叶片作 ａｕｔｏｍａｔ.ｐｌ? ｐａｇｅ ＝ ｎｐｓａ＿ｓｏｐｍａ.ｈｔｍｌ/ )和蛋白三级结
为试验材料ꎬ将叶片与叶柄一并剪下ꎬ放入干净的 构 预 测 工 具 Ｓｗｉｓｓ ｍｏｄｅｌ ( ｈｔｔｐｓ:/ / ｓｗｉｓｓｍｏｄｅｌ.
蒸馏水中转移至实验室ꎮ ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ) 对 ＨｍＡＰ３ 氨基酸序列进行分析ꎮ
试验所用的试剂盒包括植物总 ＲＮＡ 提取试剂 １.４ ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因编辑载体构建和转化
盒 [ 天 根 生 化 科 技 ( 北 京) 有 限 公 司ꎬ ＤＰ４３２]ꎬ 使 用 ＣＲＩＳＰＲ 靶 点 设 计 网 站 ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ
ｃＤＮＡ 反转录试剂盒 ( ＴａＫａＲａꎬＲＲ０４７Ａ)ꎬＤＮＡ 凝 (ｈｔｔｐ: / / ｃｒｉｓｐｒ.ｄｂｃｌｓ.ｊｐ / ) 根据 ＨｍＡＰ３ 基因的 ＣＤＳ
胶回收试剂盒 (北京擎科生物科技股份有限公司ꎬ 序列ꎬ选择 ＰＡＭ 位点和 ＧＣ 含量在 ４０％ ~ ６０％ 之
ＧＥ０１０１)ꎬＯｎｅ ｓｔｅｐ ＺＴＯＰＯ￣Ｂｌｕｎｔ/ ＴＡ 零 背 景 快 速 间的 高 特 异 性 靶 点ꎮ 以 ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｓｇＲＮＡ /
克 隆 试 剂 盒 ( 北 京 庄 盟 生 物 科 技 有 限 公 司ꎬ Ｃａｓ９ 载体质粒为模板ꎬ以 ＨｍＡＰ３￣Ｆ２ / Ｒ２、ＨｍＡＰ３￣
ＺＣ２０６)ꎬＳＥ 无缝克隆和组装试剂盒 ( 北京庄盟生 Ｆ３ / Ｒ３ 为引物 (表 １)ꎬ进行 ＰＣＲ 扩增获得带有黏
物科 技 有 限 公 司ꎬ ＺＣ２３１)ꎬ 限 制 性 内 切 酶 Ｂｓａ Ｉ 性末端的目的片段ꎮ 使用内切酶 Ｂｓａ Ⅰ酶切获得
[纽英伦生物技术(北京)有限公司]ꎮ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００￣ｓｇＲＮＡ / Ｃａｓ９ 线 性 载 体ꎬ 用 无 缝 克
１.２ 绣球‘杜丽’ＨｍＡＰ３ 基因克隆 隆试剂盒 (北京庄盟生物科技有限公司ꎬ ＺＣ２３１)
依据 在 ＮＣＢＩ 上 查 找 到 的 绣 球 ‘ Ｂｌｕｅ Ｓｋｙ’ 连接载体和目的片段ꎬ获得重组质粒ꎮ 构建好的
(Ｈ. ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌａ ‘Ｂｌｕｅ Ｓｋｙ’) ＡＰ３ 基因 (ＧｅｎＢａｎｋ: 质粒转入 ＤＨ５α 大肠杆菌感受态涂布平板培养 １２
ＡＦ２３０７０２.１) 的 ＣＤＳ 序列进行引物设计 ( 表 １) ｈꎬ选取单菌落送至测序公司 ( 北京擎科生物科技
并合成高特异性引物ꎮ 股份有限公司) 进行质粒提取和测序工作ꎬ回收构
按照试剂盒说明书提取试验材料 ＲＮＡꎬ并将 建 成 功 的 载 体 质 粒ꎮ 将 构 建 好 的 载 体
ＲＮＡ 反转录成 ｃＤＮＡꎮ 以 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ用 ＫＯＤ ｐＣＡＭＢＩＡ１３００::ＨｍＡＰ３ 利用冻融法转入 ＧＶ３１０１
￣１
Ｏｎｅ 高保真 ＤＮＡ 聚合酶 ( ＴＯＹＯＢＯꎬＫＭＭ￣１０１)ꎬ 农杆菌感受态中ꎬ在 ２ 抗 ＬＢ 培养基 (５０ ｍｇＬ
￣１
以 ＨｍＡＰ３￣Ｆ１ / Ｒ１ 为引物 ( 表 １) 进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ 卡那霉素＋５０ ｍｇＬ 利福平) 中 ２８ ℃ 培养 ２ ｄꎬ
扩增产物利用琼脂糖凝胶电泳进行纯化ꎬ将目的 挑取单菌落在 ＬＢ 液体培养基扩繁ꎮ 离心收集扩繁
片段所处区域凝胶切割下来ꎬ按照 ＤＮＡ 凝胶回收 的农杆菌菌体ꎬ加入适量侵染液 (ＭＳ＋３０ ｇＬ 蔗
￣１
试剂盒说明书回收ꎮ 纯化后的 ＰＣＲ 产物连接 Ｔ 载 糖＋２００ μｍｏｌＬ 乙酰丁香酮) 调至 ＯＤ ＝ ０.４ꎮ
￣１
６００
体后转入 ＤＨ５α 大肠杆菌感受态涂布平板培养 １２ 将绣球‘杜丽’叶片剪切成 １ ｃｍ × １ ｃｍ 的小
ｈꎬ选取单菌落送至测序公司 ( 北京擎科生物科技 块ꎬ在叶背划 ３ ~ ４ 刀ꎬ放入上述配制好的侵染液中
