Page 58 - 《广西植物》2024年第2期
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２ ６ ０ 广 西 植 物 ４４ 卷
浸泡侵染 １０ ｍｉｎꎬ转接到共培养培养基 ( ＭＳ＋２.０ 点为 ６. １７ꎮ 蛋 白 脂 肪 指 数 为 ７９. １２ꎬ 亲 水 性
ｍｇＬ ６￣ＢＡ＋０.１ ｍｇＬ ＩＢＡ) 上暗培养 ２ ｄꎬ再 (ＧＲＡＶＹ) 为 － ０. ７９１ꎬ为亲水性蛋白ꎮ ＨｍＡＰ３ 蛋
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转移到筛选培养基 ( ＭＳ ＋ ２.０ ｍｇＬ ６￣ＢＡ ＋ ０.１ 白二级结构中 α￣螺旋占比最高ꎬ为 ６４.０９％ꎻ其他
ｍｇＬ ＩＢＡ＋２ ｍｇＬ 潮霉素＋ ２００ ｍｇＬ 头孢 结构占比由高到低依次为无规则卷曲 (２２.６５％)、
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霉素) 中至获得抗性再生芽ꎮ 延伸链(８.８４％)、β￣折叠(４.４２％) (图 ３)ꎮ
１.５ 抗性芽检测和鉴定 ２.３ 绣球‘杜丽’ＡＰ３ 蛋白系统进化与 ｍｏｔｉｆ 分析
取抗性芽叶片ꎬ使用基因组提取试剂盒获取 将 ＨｍＡＰ３ 氨 基 酸 序 列 提 交 到 ＮＣＢＩ 进 行
叶片 ＤＮＡꎬ再依次使用总 ＲＮＡ 提取试剂盒、ｃＤＮＡ ＢＬＡＳＴ 比对ꎬ在比对结果中选取下载与该序列相
反转录试剂盒获取叶片 ｃＤＮＡꎮ 分别以叶片 ＤＮＡ 似度较高的其他植物 ＡＰ３ 氨基酸序列ꎬ在 ＭＥＧＡ￣
和 ｃＤＮＡ 为模板ꎬ以 Ｃａｓ９￣Ｆ / Ｒ 为引物扩增 Ｃａｓ９ 序 Ｘ 软件上用邻接法构建系统进化树 (图 ４)ꎮ 从整
列ꎬ扩增 片 段 长 度 为 ７６４ ｂｐꎮ 以 叶 片 ＤＮＡ 为 模 体上来看ꎬ绣球等蔷薇亚纲菊超目植物被聚为同
板ꎬ以 ＨｍＡＰ３￣Ｆ１ / Ｒ１ 为引物扩增抗性芽 ＨｍＡＰ３ 一大支ꎬ说明 ＡＰ３ 蛋白在系统进化过程中具有一
序列ꎬ扩增产物送至测序公司 (北京擎科生物科技 定保守性ꎮ 从各小分支来看ꎬ不同物种间的 ＡＰ３
股份有限公司) 测序ꎮ 使用 ＤＮＡＭＡＮ 比对测序结 序列存在一定差异ꎬ而同物种间的序列相似度则
果与野生型序列差异ꎮ 较 高ꎮ 相 对 而 言ꎬ 绣 球 与 神 秘 果 ( Ｓｙｎｓｅｐａｌｕｍ
ｄｕｌｃｉｆｉｃｕｍ)、 洒 金 桃 叶 珊 瑚 ( Ａｕｃｕｂａ ｊａｐｏｎｉｃａ
２ 结果与分析 ｖａｒ. ｂｏｒｅａｌｉｓ) 和欧洲枸骨 (Ｉｌｅｘ ａｑｕｉｆｏｌｉｕｍ) 亲缘关
系最近ꎮ 在模式植物中ꎬ绣球与烟草 ( Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
２.１ 绣球‘杜丽’ＡＰ３ 基因克隆与序列分析 ｔａｂａｃｕｍ) 的 亲 缘 关 系 比 拟 南 芥 ( Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
参考绣球‘ Ｂｌｕｅ Ｓｋｙ’ ＡＰ３ 基因 ＣＤＳ 序列ꎬ利 ｔｈａｌｉａｎａ) 更近ꎮ 因此ꎬ使用烟草基因组作为预测
用 ＨｍＡＰ３￣Ｆ１ / ＨｍＡＰ３￣Ｒ１ 引 物 ( 表 １)ꎬ 在 绣 球 绣球基因编辑靶点的参考基因组更为适宜ꎮ
‘杜丽’ｃＤＮＡ 文库中克隆到了一段完全一致的核 在 ＭＥＭＥ￣ｍｏｔｉｆ ｓｕｉｔｅ 工具上对上述氨基酸序
苷酸序列ꎮ 克隆到的基因序列全长 ５４６ ｂｐꎬ共编 列进行分析后ꎬ获得了 １５ 个 ｍｏｔｉｆ 及其在序列中的
码 １８１ 个氨基酸ꎬ利用 ＮＣＢＩ 分析其氨基酸序列ꎬ 相对位置 (图 ４)ꎮ 大部分植物 ＡＰ３ 序列包含 ７ 个
发现在 ３０ ~ １２３ ｂｐ 处包含 １ 个 Ｋ￣ＢＯＸ 保守结构域 ｍｏｔｉｆꎬ其中有 ８ 个 ＡＰ３ 序列包含 ８ 个 ｍｏｔｉｆꎬ１ 个
(图 １)ꎮ 该氨基酸序列 Ｃ 端含有 ＰＩ 基序和 ｅｕＡＰ３ ＡＰ３ 序列包含 ９ 个 ｍｏｔｉｆꎮ 所有 ＡＰ３ 序列 Ｃ 端较为
基序ꎬ符合 ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ 家族特征ꎬ命名为 ＨｍＡＰ３ꎮ 保 守ꎬ 均 含 有 ｍｏｔｉｆ ２、 ｍｏｔｉｆ ４、 ｍｏｔｉｆ ５、 ｍｏｔｉｆ ６ 和
将 ＨｍＡＰ３ 与拟南芥 ＡｔＡＰ３ 氨基酸序列比对ꎬ其相 ｍｏｔｉｆ ７ꎬ而 Ｎ 端多含 ｍｏｔｉｆ ３ꎮ 与其他植物相比ꎬ绣
似度为 ５８.８％ꎻＨｍＡＰ３ 与绣球‘ Ｂｌｕｅ Ｓｋｙ’ ＡＰ３ 的 球 ＡＰ３ 序列中含有特有的 ｍｏｔｉｆ １２ꎬ此外仅洒金桃
ＤＮＡ 序列相似度为 １００％ꎮ 因此ꎬ推测该基因为绣 叶珊瑚 ＡＰ３ 序列中含有这一基序ꎬ说明 ＨｍＡＰ３ 相
球‘杜丽’ ＡＰ３ 基因ꎮ 亚细胞定位预测结果显示 对其他植物 ＡＰ３ 蛋白可能会有更多功能ꎮ 对同源
ＨｍＡＰ３ 在细胞核中表达ꎮ 基因来说ꎬ其序列的 ｍｏｔｉｆ 大体相似ꎬ然而在不同
２.２ 绣球‘杜丽’ＡＰ３ 蛋白理化性质与结构分析 物种间仍存在一定的差异ꎬ这些差异导致了不同
以拟南芥 ＭＡＤＳ￣ｂｏｘ 类蛋白三级结构为模型ꎬ 物种间同源基因的功能差异ꎮ
预测 ＨｍＡＰ３ 蛋白三级结构ꎬ可见该结构中含有 ２ ２.４ ＣＲＩＳＰＲ / Ｃａｓ９ 基因编辑载体构建
条长 α￣螺 旋ꎬ 螺 旋 间 纽 结 为 ９０°ꎻ 其 预 测 结 果 利用 ＣＲＩＳＰＲｄｉｒｅｃｔ 在 ＨｍＡＰ３ 上共选取到 ２ 个
ＧＭＱＥ (全球模型质量估计) 值为 ０.３２ꎬＱＭＥＡＮ 特异性强的靶点ꎬ分别命名为 ＨｍＡＰ３￣Ｔａｇｅｔ１ (５′￣
得分为０.７４±０.０５ꎬ模型可信度和质量较高( 图 ２)ꎮ ＧＡＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＡＣＧＡＣＡＡＴ ＋ ＧＧＧ￣３′) 和 ＨｍＡＰ３￣
绣 球 ‘ 杜 丽 ’ 的 ＨｍＡＰ３ 蛋 白 分 子 式 为 Ｔａｇｅｔ２ (５′￣ ＴＧＡＡＣＧＡＡＡＧＴＡＴＣＧＡＧＴＡＣ ＋ＣＧＧ￣３′)ꎬ
Ｃ Ｈ Ｎ Ｏ Ｓ ꎬ分子量为 ２１ １７７. ８５ Ｄꎮ 该 蛋 其 ＧＣ 含量分别为 ４５ ％和 ４０ ％ꎬ其与 ＰＡＭ 位点相
９２７ １４６２ ２６８ ２８７ ７
白共包含 １８１ 个氨基酸ꎬ不稳定系数为 ３８.７９ꎬ属 邻的 １２ ｂｐ 在参考基因组 (烟草) 中均仅比对到 １
稳定蛋白ꎮ 蛋白带负电荷残基总数 ( Ａｓｐ＋Ｇｌｕ) 为 个位 点ꎬ 证 明 该 靶 点 具 有 较 强 特 异 性ꎮ 用 引 物
２８ꎬ带正电荷残基总数( Ａｒｇ＋Ｌｙｓ) 为 ２５ꎬ理论等电 ＨｍＡＰ３￣Ｆ２ / Ｒ２、ＨｍＡＰ３￣Ｆ３ / Ｒ３ 在质粒上扩增含有
