Page 165 - 《广西植物》2024年第5期

５ 期 闫海锋等: 檀香 ＮＤＨ 脱氢酶基因的克隆、定位与启动子分析 ９ ５ ３

ＳｕｂＥＤ(ＮｄｈＳ、 ＮｄｈＶ、 ＮｄｈＴ 和 ＮｄｈＵ) 也由核基因 置于 ＭＳ 液体培养基中ꎬ在 ２５ ℃ 、１００ ｒｍｉｎ 条件
￣１
组编码ꎬ其均能与 ＳｕｂＡ 相互作用形成 Ｆｄ 结合位 下黑暗培养 ２４ ｈꎬ之后分别加入终浓度为 １ × １０ ￣４
￣１
点( Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１ꎻ Ｐｅｌｔｉｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎮ ｍｏｌＬ 的茉莉酸甲酯溶液( ＭｅＪＡ) 和赤霉素溶液
高等植物在进化过程中 ＮＤＨ 与 ＰＳＩ 形成了复合 (ＧＡ )ꎬ分别在 ０、３、６ ｈ 取样ꎬ液氮速冻后置于－８０
３
体ꎬ从而提高了电子传递效率并在逆境条件下有 ℃ 保存以提取 ＲＮＡꎮ 每处理均设置 ３ 次重复ꎮ
利于 ＮＤＨ 复合体的结构保持稳定ꎬ拟南芥 Ｌｈｃａ５ １.２ ＳａＮＤＨ６ 的克隆
和 Ｌｈｃａ６ 在此复合体的形成中起连接作用ꎬ并且 采用提取木本植物 ＲＮＡ 方法(Ｋｏｌｏｓｏｖａ ｅｔ ａｌ.ꎬ

Ｌｈｃａ６ 还能 够 稳 定 ＮＤＨ 复 合 体 的 结 构 ( Ｐｅｎｇ ｅｔ ２００４)提取檀香心材总 ＲＮＡꎬ用 ＮａｎｏＤｒｏｐ ＮＤ￣１０００
ａｌ.ꎬ ２００９)ꎮ 最近 Ｏｔａｎｉ 等(２０１８) 研究发现ꎬ有更 分 光 光 度 计 ( Ｎａｎｏｄｒｏｐ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓꎬ Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎꎬ
多捕光复合体 Ｉ 蛋白分子参与了 ＮＤＨ￣ＰＳＩ 复合体 ＮＣꎬ ＵＳＡ)和 １.５％琼脂糖凝胶电泳检测提取 ＲＮＡ
的形成ꎬ这些蛋白分子包括 Ｌｈｃａ１、２、３、４ꎬ它们通 的质量和完整性ꎮ
过不同组合形成 ２ 个复合体ꎬ从而连接 ＮＤＨ 和 采 用 ＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ
ＰＳＩꎮ 目前对 ＮＤＨ 复合体的结构已有较为深入的 ( Ｃｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ.ꎬ ＣＡꎬ ＵＳＡ ) 扩 增
研究ꎬ但一些组成亚基ꎬ特别是与 ＮＤＨ￣ＰＳＩ 复合体 ＳａＮＤＨ６ 的全长序列ꎬ用巢式 ＰＣＲ 进行 ＲＡＣＥ 扩
结合并不紧密的组分仍然知之甚少ꎬ同时对其功 增ꎮ 扩增产物经 １.５％ 琼脂糖凝胶电泳检测后进
能和调控机制还需进一步探究(Ｆａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５)ꎮ 行回收ꎬ连接 ＰＭＤ１８￣Ｔ 载体ꎬ转化大肠杆菌 ＤＨ￣
檀香(Ｓａｎｔａｌｕｍ ａｌｂｕｍ) 是分布于热带和亚热 ５αꎬ挑取阳性克隆到北京华大基因公司( 深圳) 测
带地区的半寄生性珍贵林木ꎬ其木材不仅质地坚 序ꎮ 基因全长扩增(３′ ＲＡＣＥ、５′ ＲＡＣＥ 和 ＯＲＦ)引
韧优良ꎬ还含有芳香精油ꎬ被广泛应用于香料、香 物见表 １ꎮ
薰、雕 刻 和 医 药 等 方 面ꎬ 具 有 很 高 的 经 济 价 值 １.３ ＳａＮＤＨ６ 的生物信息学分析
(Ｂａｌｄｏｖｉｎｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１)ꎮ 当前ꎬ关于檀香的研究 ＳａＮＤＨ６ 的 理 化 性 质 预 测 用 Ｅｘｐｙ Ｐｒｏｔｐａｒａｔ
主要集中在其精油的合成和调控等方面ꎬ对其光 (ｈｔｔｐｓ: / / ｗｅｂ.ｅｘｐａｓｙ.ｏｒｇ / ｃｇｉｂｉｎ / Ｐｒｏｔｐａｒａｍ. ｈｔｍＬ)ꎬ
合特性的研究十分缺乏ꎮ ＮＤＨ 复合体是檀香光合 亚 细 胞 定 位 预 测 利 用 ｐｌａｎｔ￣ｍＰｌｏ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.
作用时进行电子传递的重要组分ꎬ由哪些基因组 ｃｓｂｉｏ. ｓｊｔｕ.ｅｄｕ. ｃｎ / ｂｉｏｉｎｆ/ ｐｌａｎｔ￣ｍｕｌｔｉ/ )ꎮ 不同植物
成ꎬ这些基因的功能和调控如何ꎬ关于这些科学问 ＮＤＨ 亚基的氨基酸序列比对用 ＤＮＡＭＡＮ 软件ꎬ通
题目前并不明确ꎮ 本文以檀香木质部为材料ꎬ采 过 ＭＥＧＡ ６.０ 的邻位相连法( Ｎ￣Ｊ 法) 建立不同植
用分子生物学相关技术方法ꎬ通过檀香 ＳａＮＤＨ６ 基 物 ＮＤＨ 基因的系统进化树ꎮ
因的克隆、进化树、亚细胞定位、组织表达模式、启 １.４ ＳａＮＤＨ６ 的亚细胞定位
动子顺式作用元件和可能结合的转录因子分析ꎬ 檀香基因组序列从 ＮＣＢＩ 下载ꎬ下载序列号为
探讨 ＳａＮＤＨ６ 在檀香 ＮＤＨ 复合体中的具体定位和 ＧＣＡ＿００２９２５７７５.１(Ｍａｈｅｓｈ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８)ꎬ参照玉米、
可能的作用ꎬ分析其表达调控模式和其在逆境胁 水稻和拟南芥基因组数据进行相应注释ꎬ然后提取
迫中可能发挥的作用ꎬ为檀香 ＮＤＨ 复合体在光合 ＳａＮＤＨ６ 基 因 的 启 动 子 序 列ꎬ 并 用 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ

作用以及逆境胁迫中的功能研究奠定基础ꎮ ( ｈｔｔｐ:/ / ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ｐｓｂ. ｕｇｅｎｔ. ｂｅ / ｗｅｂｔｏｏｌｓ /
ｐｌａｎｔｃａｒｅ/ ｈｔｍｌ/ )进行分析ꎮ 启动子 ＴＦ 结合位点预测
１ 材料与方法 利用 ＰｌａｎｔＲｅｇＭａｐ: Ｐｌａｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ Ｄａｔａ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ

Ｐｌａｔｆｏｒｍ ＠ ＣＢＩꎬ ＰＫＵ ( ｈｔｔｐ:/ / ｐｌａｎｔｒｅｇｍａｐ. ｃｂｉ. ｐｋｕ.
１.１ 植物材料和处理 ｅｄｕ.ｃｎ/ ｂｉｎｄｉｎｇ＿ｓｉｔｅ＿ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ.ｐｈｐ)进行分析ꎮ
檀香叶片、根和心材均取自中国科学院华南 扩增 ＳａＮＤＨ６ 的 ＯＲＦ 序 列 ( 去 除 终 止 密 码

植物园檀香种植基地的 ７ 龄檀香树( 至少选择 ３ 子)ꎬ 利 用 Ｉｎ￣ｆｕｓｉｏｎ 技 术 构 建 ３５Ｓ: ＳａＮＤＨ６:
棵正常生长树木进行取材)ꎬ液氮速冻后带回实验 ｐＳＡＴ６￣ＥＹＦＰ￣Ｎ１ 亚细胞定位载体ꎬ 测序确认后按照
室－８０ ℃ 保存ꎮ 取檀香嫩枝为外植体进行愈伤组 Ｙｏｏ 等(２００７)的方法进行拟南芥原生质体转化ꎬ
织 诱 导ꎬ 诱 导 参 照 Ｓｉｎｇｈ 等 ( ２０１５ ) 和 Ｙａｎ 等 在 ２２ ℃ 、弱光下培养 １２ ｈ 后利用激光共聚焦扫描
(２０１８)的方法ꎮ 在超净台称取等量檀香愈伤组织 电镜(Ｚｅｉｓｓꎬ Ｊｅｎａꎬ Ｇｅｒｍａｎｙ)观察并拍照ꎮ