Page 166 - 《广西植物》2024年第5期
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９ ５ ４ 广 西 植 物 ４４ 卷
表 １ 本文使用的引物 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 用 ＡＢＩ ７５００ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｓｙｓｔｅｍ ( ＡＢＩꎬ
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ Ａｌａｍｅｄａꎬ ＣＡꎬ ＵＳＡ) 进 行 测 定ꎮ 反 应 试 剂 采 用
ＴＭ ®
ＳｏＡｄｖａｎｃｅｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ
序列 (５′￣３′)
用途 引物名称
Ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
Ｕｓｅ ａｇｅ Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ( Ｂｉｏ￣Ｒａｄꎬ Ｈｅｒｃｕｌｅｓꎬ ＣＡꎬ ＵＳＡ)ꎮ
(５′￣３′)
®
反应体系:ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ ５ μＬꎬ引物 (１×
３′ ＲＡＣＥ ＳａＮＤＨ６３′￣Ｆ１ ＧＧＴＧＡＧＧＣＣＡＴ
￣１
￣５
ＴＣＣＡＧＴＴＣＴＴ １０ ｍｏｌＬ )各 ０.５ μＬꎬ ｃＤＮＡ １ μＬꎬ加入 ｄｄＨ Ｏ
２
３′ ＲＡＣＥ ＳａＮＤＨ６３′￣Ｆ２ ＣＡＣＴＧＧＡＴＴＴＧ 至总体系达到 １０ μＬꎮ 反应条件为 ９５ ℃ 预变性 ２
ＣＡＣＴＧＣＣＴＧＣ
ｍｉｎꎬ ９５ ℃ 变性 １５ ｓꎬ６０ ℃ 退火 １ ｍｉｎꎬ４０ 个循环ꎮ
５′ ＲＡＣＥ ＳａＮＤＨ６５′￣Ｒ１ ＡＴＴＣＴＡＧＧＧＴＣＣ
按照 Ｙａｎ 等(２０１８) 的方法选取相应内参基因ꎬ不
ＧＡＡＧＣＡＡＣＡＴＣＣ
５′ ＲＡＣＥ ＳａＮＤＨ６５′￣Ｒ２ ＣＡＡＧＧＡＧＧＣＡＧＡ
ＧＡＴＡＧＴＧＧＴＧＧＴ 同组织中利用 ＳａＦＡＢ１Ａ＋ＳａＰＰ２ＣꎬＭｅＪＡ 处理利用
ＯＲＦ 扩增 ＳａＮＤＨ６ＯＲＦ￣Ｆ ＧＡＴＣＣＡＡＣＧＧＣＴ ＳａＣＳＡ＋ＳａＦｂｐ３ꎬＧＡ 处理利用 ＳａＰＰ２Ｃ＋ ＳａＦｂｐ２ 作
ＯＲＦ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＡＴＡＴＡＡＴＧ ３
为内参基因ꎬ以两个相应内参基因表达量的算术
ＳａＮＤＨ６ＯＲＦ￣Ｒ ＡＡＴＣＡＣＣＡＣＴＣＡ
ＧＧＧＡＡＡＡＣ 平均值作为内参基因的最终表达量值分别进行校
构建 ＳａＮＤＨ６: ｐＳＡＴ６￣ ＳａＮＤＨ６Ｆ１ＹＦＰ￣Ｆ ＣＧＡＡＣＧＡＴＡＧＣＣ
正ꎮ 每个样品均设置 ３ 次重复ꎬ最后用 ２ －ΔΔＣｔ 方法
ＥＹＦＰ￣Ｎ１ 载体 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ＡＴＧＧＴＡＡＴＧＡＡＴＧ
ｏｆ ＳａＮＤＨ６: ｐＳＡＴ６￣ ＧＴＧＣＴＴＴＣＡＡＡＴ
分析定量数据ꎮ ＲＴ￣ｑＰＣＲ 所用引物见表 １ꎮ
ＥＹＦＰ￣Ｎ１ ｖｅｃｔｏｒ
ＳａＮＤＨ６Ｆ１ＹＦＰ￣Ｒ ＴＧＡＧＴＣＣＧＧＡＣＣ １.６ 数据统计分析
ＡＴＧＧＴＡＴＡＣＴＴＣＣ
ＴＣＣＧＣＣＡＡＧＡＧＴ
用 ＳＰＳＳ １９.０(ＩＢＭ Ｃｏｒｐ.ꎬ Ａｒｍｏｎｋꎬ ＮＹꎬ ＵＳＡ)
实时荧光定量 ＲＴ￣ｑＰＣＲ ＳａＮＤＨ６ｑｐｃｒ￣Ｆ ＧＣＧＧＣＣＴＴＣＴＣＴ
ＴＧＣＴＴＡＴＴＡ 进行数据统计分析ꎮ 多重比较采用邓肯式新复极
ＳａＮＤＨ６ｑｐｃｒ￣Ｒ ＡＣＣＴＣＣＣＴＧＴＴＴ 差法(Ｐ<０.０５)ꎮ
ＣＡＣＣＡＡＴＡＡＣ
ＳａＦＡＢ１Ａ(ＲＴ￣ｑＰＣＲ)￣Ｆ ＡＧＣＡＧＴＴＣＴＣＡＡ
ＡＧＧＡＧＣＴＡＡＡ ２ 结果与分析
ＳａＦＡＢ１Ａ(ＲＴ￣ｑＰＣＲ)￣Ｒ ＡＣＣＴＴＣＧＴＧＣＧＡ
ＣＡＡＣＴＡＡＡ
ＳａＰＰ２Ｃ(ＲＴ￣ｑＰＣＲ)￣Ｆ ＡＣＴＧＡＣＣＡＧＧＣＡ ２.１ ＳａＮＤＨ６ 的克隆
ＡＴＣＣＴＴＴＣ
根据檀香转录组注释的 ＮＤＨ 脱氢酶 Ｕｎｉｇｅｎｅ
ＳａＰＰ２Ｃ(ＲＴ￣ｑＰＣＲ)￣Ｒ ＡＴＣＣＡＴＡＡＣＣＴＴ
设计引物ꎬ３′ ＲＡＣＥ 扩增后得到一条 ５２８ ｂｐ 的特
ＣＧＧＣＣＡＴＴＴＡ
ＳａＣＳＡ(ＲＴ￣ｑＰＣＲ)￣Ｆ ＧＣＣＡＡＴＡＴＡＣＣＧ
异条带( 图 １:Ａ)ꎬ５′ ＲＡＣＥ 扩增后得到一条 ３１７
ＡＧＧＡＣＡＧＡＡＧ
ｂｐ 的特异条带( 图 １:Ｂ)ꎬ经测序后均能与已有序
ＳａＣＳＡ(ＲＴ￣ｑＰＣＲ)￣Ｒ ＣＡＡＣＣＧＣＡＡＧＡＴ
ＣＡＣＡＡＡＣＡＧ
列正确拼接ꎬ并且在 ３′端有 Ｐｏｌｙ Ａ 序列ꎬ说明正确
ＳａＦｂｐ３(ＲＴ￣ｑＰＣＲ)￣Ｆ ＣＣＴＣＧＴＧＴＡＣＴＧ
ＧＧＡＡＡＴＧＧ 地得到了其 ３′和 ５′端序列ꎮ 经 ＮＣＢＩ ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ
分析并拼接后ꎬ通过 ＲＴ￣ＰＣＲ 扩增后得到了一条
ＳａＦｂｐ３(ＲＴ￣ｑＰＣＲ)￣Ｒ ＧＣＡＡＧＡＡＣＧＣＡＡ
ＴＧＣＣＴＡＡＡ
９１２ ｂｐ 的目标条带( 图 １:Ｃ)ꎬ测序后得到了目标
ＳａＦｂｐ２(ＲＴ￣ｑＰＣＲ)￣Ｆ ＣＧＡＡＧＣＣＴＧＧＴＴ
ＣＡＣＴＣＴＡＴＧ
序列ꎬ并命名为 ＳａＮＤＨ６ꎮ
ＳａＦｂｐ２(ＲＴ￣ｑＰＣＲ)￣Ｒ ＡＡＧＣＴＡＡＧＣＣＴＣ
ＴＧＣＡＡＴＧＴ ２.２ ＳａＮＤＨ６ 的生物信息学分析
ＳａＮＤＨ６ 编码 ３０３ 个氨基酸( 图 ２)ꎬ蛋白分子
量为 ３３.７５ ｋＤａꎬ理论等电点为 ９.３１ꎬ含有 ２８ 个酸
１.５ 实时荧光定量 ＰＣＲ 分析 性氨基酸和 ４５ 个碱性氨基酸ꎬ带电氨基酸共有 ７６
用 １.１ 所述的方法分别提取檀香叶片、心材、 个ꎬ极性不带电氨基酸共有 ７９ 个ꎬ并且含有 １６０
根 和 愈 伤 组 织 总 ＲＮＡꎬ 用 ＲＮａｓｅ ｆｒｅｅ ＤＮａｓｅ Ｉ 个疏水氨基酸ꎬ说明其为疏水蛋白ꎮ 亚细胞定位
(ＴａＫａＲａꎬ Ｊａｐａｎ)进行处理ꎬ以确保无 ＤＮＡ 污染ꎮ 预测表明其可能定位于叶绿体ꎮ
用 Ａ / Ａ 在 １.９ 到 ２.１、Ａ / Ａ 大于 ２.０ 且电泳 从 ＮＣＢＩ 下载不同植物 ＮＤＨ 亚基的氨基酸序
２６０ ２８０ ２６０ ２３０
后条带 完 整 的 １ μｇ ＲＮＡ 进 行 反 转 录ꎮ 获 得 的 列ꎬ利用 ＤＮＡＭＡＮ 进行多重序列比对ꎮ 由图 ３ 可
ｃＤＮＡ 用无核酸酶的水稀释 １０ 倍后置于 － ２０ ℃ 知ꎬ檀香 ＳａＮＤＨ６ 与桃( Ｐｒｕｎｕｓ ｐｅｒｓｉｃａ) ＰｐＮｄｈ６ 的
备用ꎮ 序列相似度为 ５３.４６％ꎬ与芝麻( Ｓｅｓａｍｕｍ ｉｎｄｉｃｕｍ)
