Page 165 - 《广西植物》2025年第3期
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３ 期 刘宝骏等: 文采报春苣苔 ＰｗＤＲＥＢ２ｓ 基因的克隆与表达分析 ５ ４ ５
１.２.２ ＲＮＡ 提取与 ｃＤＮＡ 合成 使用 ＥＡＳＹ ｓｐｉｎ 植 程(上海)股份有限公司进行 ＤＮＡ 测序ꎮ
物 ＲＮＡ 快速提取试剂盒( ＲＮ０９ꎬ艾德莱生物科技 １.２.４ 系统进化与保守基序分析 利用 ＣｌｕｓｔａｌＸ 和
有 限 公 司ꎬ 中 国 北 京 ) 提 取 总 ＲＮＡꎬ ＮａｎｏＤｒｏｐ Ｇｅｎｅｄｏｃ 软件进行氨基酸序列比对ꎮ 基于前人对
２０００ｃ 分光光度计和 １.０％琼脂糖(１×ＴＢＥ) 凝胶电 ＤＲＥＢ 亚 族 和 Ａ￣２ 亚 组 不 同 亚 型 的 聚 类 结 果
泳检测 ＲＮＡ 浓度、纯度和完整性ꎬｃＤＮＡ 第一链合 (Ｓａｋｕｍａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００２ꎻＮａｋａｎｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００６ꎻＭｉｚｏｉ ｅｔ
® ｒｅａｇｅｎｔ 试 剂 盒 ａｌ.ꎬ ２０１３ꎻ Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１４ )ꎬ 选 取 ２５ 条 典 型 的
成 采 用 ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ ＲＴ
(ＤＲＲ０４７Ａꎬ ＴａＫａＲａꎬ Ｊａｐａｎ)ꎬ反应体系见附表 １ꎬ ＤＲＥＢ 亚族转录因子的全长序列和 １５ 条 Ａ￣２ 亚组
ｃＤＮＡ 于－２０ ℃ 冰箱保存ꎮ 转录因子的 ＡＰ２ / ＥＲＦ 保守域及侧翼序列( 另选取
１.２.３ ＰｗＤＲＥＢ２ｓ 基因的扩增 课题组前期构建了 ＤＲＥＢ１ / ＣＢＦ 亚组与 ＥＲＦ 亚族成员各 １ 条)ꎬ使用
干热复合胁迫下文采报春苣苔的 ｃＤＮＡ 文库ꎬ并通 ＭＥＧＡ ５.０ 软件ꎬ通过邻接法(ｎｅｉｇｈｂｏｒ ｊｏｉｎｉｎｇꎬ ＮＪ)
过二代转录组测序技术获得了从头组装的序列信 构建系 统 进 化 树ꎬ设 定１ ０００ 次 重 复 进 行 自 展 值
息ꎮ 基 于 ＡＰＧ Ⅳ 被 子 植 物 系 统 进 化 分 析 结 果 (ｂｏｏｔｓｔｒａｐ)检验ꎬ氨基酸序列 Ｇｅｎｂａｎｋ 注册号见附
(Ｔｈｅｏｄｏｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１９ )ꎬ 从 ＮＣＢＩ 网 站 ( ｈｔｔｐ: / / 表 ５ꎮ 使 用 在 线 工 具 ＭＥＭＥ ( ｈｔｔｐ: / / ｍｅｍｅ￣ｓｕｉｔｅ.
ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏｖ) 基因组数据库中获取报春 ｏｒｇ / ｔｏｏｌｓ/ ｍｅｍｅ)进行保守基序预测ꎬ参数设置:每
苣苔属植物的 ＤＲＥＢ２ 同源基因ꎬ包括怀集报春苣 条序列中单个基序出现的次数为 ０ 或 １ꎬ基序宽度
苔(Ｐｒｉｍｕｌｉｎａ ｈｕａｉｊｉｅｎｓｉｓ)、牛耳朵( Ｐ. ｅｂｕｒｎｅａｎ) 和 范围为 ６ ~ ５０ 个氨基酸残基ꎬ基序最大数目为 １５ꎮ
报春苣苔( Ｐ. ｔａｂａｃｕｍ) ( Ｆｅｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０ｂꎻＫｅ ｅｔ 利用 Ｔｏｍｔｏｍ 工 具 对 预 测 的 保 守 基 序 进 行 ｍｏｔｉｆ
ａｌ.ꎬ ２０２２ꎻＹｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２)ꎬ再将其作为查询序列ꎬ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎꎬ 数 据 库 选 择 ＰＲＯＳＩＴＥ ｆｉｘｅｄ￣ｌｅｎｇｔｈ
在文采报春苣苔转录组数据中进行本地 ＢＬＡＳＴꎬ ｍｏｔｉｆｓꎮ
结合功能注释信息ꎬ对 ＰｗＤＲＥＢ２ｓ 基因进行筛选 １.２.５ 半定量 ＲＴ￣ＰＣＲ 表达分析 基于近缘种石蝴
与分析ꎮ 根据推测的起始密码子和终止密码子ꎬ 蝶属(Ｐｅｔｒｏｃｏｓｍｅａ ｓｐｐ.)与钟冠报春苣苔(Ｐｒｉｍｕｌｉｎａ
确定每个基因的编码区( ｃｏｄｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎬ ＣＤＳ) 长 ｓｗｉｎｇｌｅｉ) 的 ｑＲＴ￣ＰＣＲ 研究ꎬ选择 ＰｓＡＣＴ 作为文采
度ꎬ所获得的序列信息见附表 ２ꎮ 对于转录组中序 报春苣苔的看家基因( Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５ꎻＦｅｎｇ ｅｔ
列信息不完整的基因ꎬ采用改良的交错式热不对 ａｌ.ꎬ ２０２０ａ)ꎬ引物序列详见附表 ６ꎮ 反应程序:９５
称 ＰＣＲ ( ｔｈｅｒｍａｌ ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ｉｎｔｅｒｌａｃｅｄ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ℃ ３ ｍｉｎꎻ( ９５ ℃ ３０ ｓꎬ６０ ℃ ３０ ｓꎬ７２ ℃ ３０ ｓ) ×
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎꎬ ｔａｉｌ￣ＰＣＲ) 来获取缺少的侧翼序列 (２７ / ３２)个循环ꎻ７２ ℃ １０ ｍｉｎꎮ 其中ꎬ内参 ＰｓＡＣＴ
(Ｗａｎｇ Ｚ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１１)ꎮ 以 文 采 报 春 苣 苔 叶 片 的 ＰＣＲ 循环数设定为 ２７ꎬ目的基因 ＰｗＤＲＥＢ２ｓ 的
ｃＤＮＡ 和 ｇＤＮＡ 为模板ꎬ利用特异引物和 Ｐｆｕ 酶进 ＰＣＲ 循环数设定为 ３２ꎮ
行 ＰＣＲ 扩增ꎬ反应体系见附表 ３ꎬ引物设计使用 １.２.６ 实时荧光定量 ＰＣＲ 表达分析 为揭示在液体
Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５. ０ꎬ 引 物 序 列 详 见 附 表 ４ꎮ 模 板 培养条件下不同组织中的候选基因在 ４ 个处理组之
ｃＤＮＡ 使用 ６ 种单一胁迫下的 ｃＤＮＡ 等量混合ꎬ模 间是否存在差异表达ꎬ分别采集了 ＣＫ１、Ｄ１、Ｈ１ 和
板 ｇＤＮＡ 提 取 参 照 改 良 ＣＴＡＢ 法 ( Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ＤＨ１ 组的根状茎与肉质叶样品ꎮ 此外ꎬ为探究在土
２０１１)ꎮ 为 提 高 ＰＣＲ 产 物 的 特 异 性ꎬ 采 用 降 落 壤基质栽培条件下候选基因在 ４ 个处理组之间是否
ＰＣＲ(ｔｏｕｃｈ ｄｏｗｎ ＰＣＲ) 进行扩增ꎬ反应条件:９４ ℃ 存在差异表达ꎬ分别采集了 ＣＫ２、Ｄ２、Ｈ２ 和 ＤＨ２ 组
预变性 ３ ｍｉｎꎻ９４ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ(Ｔｍ＋１０ ℃)退火 ３０ 的肉质叶样品ꎮ 所有 ｃＤＮＡ 样品用 ＲＮａｓｅ￣ｆｒｅｅ 水稀
ｓꎬ７２ ℃延伸 １ ｍｉｎꎬ以后每个循环依次降低 １ ℃ꎬ直 释 ５ 倍后作模板ꎬ引物序列详见附表 ６ꎬ采用 Ｌｉｎｅ
到(Ｔｍ－５ ℃)ꎬ共 １５ 个循环ꎻ９４ ℃变性 ３０ ｓꎬ(Ｔｍ－５ Ｇｅｎｅ ９６００ 荧光定量 ＰＣＲ 检测系统(ＦＱＤ￣９６Ａꎬ博日
℃)退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃延伸 １ ｍｉｎꎬ共 ２０ 个循环ꎻ７２ ℃ 科技有限公司ꎬ中国杭州)ꎬ反应程序:９５ ℃ ２ ｍｉｎꎻ
延伸 １０ ｍｉｎꎮ 最终扩增产物在 １. ５％ 琼脂糖 (１ × (９５ ℃ ５ ｓꎬ６０ ℃ ３４ ｓ)×４０ 个循环ꎻ９５ ℃ １５ ｓꎬ６０ ℃
ＴＡＥ)凝胶上进行检测( Ｋｏｒｂｉｅ ＆ Ｍａｔｔｉｃｋꎬ ２００８)ꎮ ６０ ｓꎬ９５ ℃ １５ ｓꎬ反应体系见附表 ７ꎮ 以 ＰｓＡＣＴ 为内
使用 ＤＮＡ 凝胶回收试剂盒(Ｂ１１００９２ꎬＤｉａｍｏｎｄꎬ中 参ꎬ相 对 表 达 量 的 计 算 公 式 为 ２ －ΔΔＣｔ ( Ｌｉｖａｋ ＆
国上海)纯化扩增产物ꎬ连接到 ｐＭＤ １８￣Ｔ 克隆载 Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎꎬ ２００１)ꎬ将 ＣＫ 组根状茎或肉质叶样品的
ＴＭ
体上ꎬ将含有重组质粒的阳性菌落送至生工生物工 表达量设定为 １ꎬ相对表达量转换为柱形图数据的
