Page 53 - 《广西植物》2025年第5期

５ 期 熊霜等: 三脉水丝梨叶绿体基因组特征及系统发育分析 ８ ５ ７

需要整合更多的基因或基因组数据ꎮ 随着二代测 Ｒｅｐｅａｔ Ｆｉｎｄｅｒ 确定反向重复序列ꎬ再通过 ＮＣＢＩ 中
序技术的发展ꎬ叶绿体全基因组广泛用于研究植 的 ｂｌａｓｔ 查 找 相 似 度 最 高 的 序 列 [ 蚊 母 树
物的系统发育ꎮ 叶绿体基因组大小一般为 １０７ ~ (Ｄｉｓｔｙｌｉｕｍ ｒａｃｅｍｏｓｕｍ)] 作为参考ꎬ并使用在线软
２１８ ｋｂꎬ测序成本低ꎬ较核基因组具有保守性、遗传 件 ＧｅＳｅｑ ( ｈｔｔｐｓ: / / ｃｈｌｏｒｏｂｏｘ. ｍｐｉｍｐ￣ｇｏｌｍ. ｍｐｇ. ｄｅ /
稳定性和不存在基因重组等优点ꎬ更适合应用于 ｇｅｓｅｑ.ｈｔｍｌ)对序列进行注释(Ｔｉｌｌｉｃｈ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ

植物系统发育和进化研究( Ｃｏｒｒｉｖｅａｕ ＆ Ｃｏｌｅｍａｎꎬ 将注释好的序列在 Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅ ２０２３ 进行手动
１９８８ꎻ Ｇｒｅｖｉｃｈ ＆ Ｄａｎｉｅｌｌꎬ ２００５ꎻ Ｒａｖｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００８ꎻ 矫正ꎬ并将注释好的序列上传至 ＮＣＢＩ 数据库( 登
Ｄａｎｉｅｌｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６)ꎮ 水丝梨属中水丝梨的叶绿 录号 为 ＰＰ６２５９７１ )ꎮ 通 过 在 线 软 件 ＣＰＧＶｉｅｗ
体基因组有详细报道( Ｐｅｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０)ꎬ而水丝 (ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.１ｋｍｐｇ. ｃｎ / / ｃｐｇｖｉｅｗ) 绘制三脉水丝
梨属其余物种叶绿体基因组特征和系统发育相关 梨叶绿体基因组的环形物理图谱ꎮ

分析等尚未见详细报道ꎮ １.３ 叶绿体基因组重复序列与 ＳＳＲ 分析
本研究对三脉水丝梨叶 绿 体 基 因 组 进 行 测 使用 ＲＥＰｕｔｅｒ(Ｋｕｒｔｚ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００１) 检测三脉水
序、组装和注释ꎬ结合公共数据库已有的金缕梅科 丝梨叶绿体基因组的散在重复序列ꎬ具体参数设
叶绿体基因组数据ꎬ进行了比较基因组和系统发 定如下:最小重复长度为 ３０ ｂｐꎬ汉明距离为 ３ꎮ 使
育分析ꎬ为探讨水丝梨属与假蚊母属、波斯铁木属 用 ＭＩＳＡ(Ｂｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７) 分析三脉水丝梨叶绿
及蚊母树属之间的关系提供新的分子证据ꎮ 本研 体基因组的简单重复序列ꎬ参数设置单核苷酸到
究拟探讨以下科学问题:(１) 三脉水丝梨的叶绿体 六核苷酸的最小重复次数分别为 １０、５、４、３、３ 和
基因组的分子结构ꎻ(２)三脉水丝梨叶绿体基因组 ３ꎮ 此 外ꎬ 串 联 重 复 序 列 通 过 Ｔａｎｄｅｍ Ｒｅｐｅａｔｓ
的重复序列、ＳＳＲｓ 位点及密码子偏好性ꎻ(３) 基于 Ｆｉｎｄｅｒ(Ｂｅｎｓｏｎꎬ １９９９)进行分析ꎮ
叶绿体基因组数据构建金缕梅科系统发育树ꎬ分 １.４ 密码子偏好性分析
析三脉水丝梨的系统位置ꎮ 使用 Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅ ２０２３ 提取三脉水丝梨叶
绿体基因组的 ＣＤＳ 序列ꎬ筛选出序列长度≥３００
１ 材料与方法 ｂｐ 的 ＣＤＳ 序列ꎬ重复序列只保留一条ꎬ确保序列
中碱基类型仅包含 Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ 且序列中间没有终
１.１ 研究材料及 ＤＮＡ 提取、测序 止密 码 子ꎮ 运 行 ＣｏｄｏｎＷ ｖ１. ４. ２ 软 件 ( Ｐｅｄｅｎꎬ
三脉水丝梨植物分子材料采集于昭通市大关 ２００５) 计 算 相 对 同 义 密 码 子 使 用 度 ( ｒｅｌａｔｉｖｅ
县三江口林场(１０３°５６′２０″ Ｅ、２８°１２′４７″ Ｎ)ꎬ选取 ｓｙｎｏｎｙｍｏｕｓ ｏｆ ｃｏｎｄｏｎ ｕｓａｇｅꎬ ＲＳＣＵ) 和有效密码子
生长状态良好的新鲜叶片ꎬ置于变色硅胶中进行 数( ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｃｏｄｏｎꎬ ＥＮＣ)ꎮ 用 ＥＭＢＯＳＳ
干燥处理ꎬ样品编号为 ０８ＣＳ３５８ꎬ标本保存在中国 ( ｈｔｔｐｓ: / / ｗｗｗ. ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ. ｎｌ/ ｅｍｂｏｓｓ￣ｅｘｐｌｏｒｅｒ / )
科 学 院 昆 明 植 物 研 究 所 标 本 馆 ( 编 号: 中的 ＣＵＳＰ 程序计算每条 ＣＤＳ 序列的 ＧＣ 总含量
ＫＵＮ１３２５５７３)ꎮ 采用改良的 ＣＴＡＢ 法( Ｐｏｒｅｂｓｋｉ ｅｔ 以及密码子 ３ 个位置的 ＧＣ 含量(分别记作 ＧＣ 、
ａｌｌ
ａｌ.ꎬ １９９７) 提取干燥叶片的 ＤＮＡꎬ并对 ＤＮＡ 纯度 ＧＣ 、ＧＣ 和 ＧＣ )ꎮ ＧＣ 和 ＧＣ 的平均值以及同义
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１
２
１
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进行分析( ＯＤ２６０ / ＯＤ２８０ 为 １.９１ꎻ浓度为 １６０.９６ 密码子第 ３ 位的 ＧＣ 含量分别记作 ＧＣ 和 ＧＣ ꎮ
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ｎｇ μＬ )ꎮ 测 量 合 格 后 通 过 超 声 波 将 提 取 的 对计算出的 ＥＮＣ 值进行排序ꎬ两端各选出 ５
￣１
ＤＮＡ 破碎为 １５０ ｂｐ 片段构建文库来进行高通量 个基因建立高、低 表 达 基 因 库ꎬ计 算 ΔＲＳＣＵ 值ꎮ
测序ꎬ测序共获得 ２.１ Ｇ ｒａｗ ｄａｔａꎮ 测序产生的原 选取 ΔＲＳＣＵ>０.０８ 的密码子作为高表达密码子ꎮ
结合 ＲＳＣＵ>１ 的高频率密码子与 ΔＲＳＣＵ>０.０８ 高
始 数 据 已 上 传 至 ＮＣＢＩ 数 据 库 ( Ｓｕｂｍｉｓｓｉｏｎ ＩＤ:
ＳＵＢ１４３７０１６１ꎻ ＢｉｏＰｒｏｊｅｃｔ ＩＤ: ＰＲＪＮＡ１０９８４８１)ꎮ 表达密码子得到最优密码子ꎮ
１.２ 叶绿体基因组的组装与注释 以每条序列的 ＥＮＣ 和 ＧＣ 分别为纵坐标和横
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通过 ｆａｓｔｐ ｖ０. ２３. ２ 对 原 始 数 据 进 行 质 控 坐标绘制 ＥＮＣ￣ｐｌｏｔ 散点图ꎮ 以每条序列的 ＧＣ 和
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(Ｃｈｅｎꎬ ２０２３)ꎬ随后使用 ＧｅｔＯｒｇａｎｅｌｌｅ ｖ１.７.３.５ 软 ＧＣ 分别为横坐标和纵坐标绘制散点图及拟合直
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线ꎬ并计算相关性ꎮ 利用软件 ＭＥＧＡ ｖ７.０.２６ 计算
件( Ｊｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０) 对叶绿体基因组进行组装ꎮ
组装好的序列先导入 Ｇｅｎｅｉｏｕｓ Ｐｒｉｍｅ ２０２３ 中使用 密码子第 ３ 位每个碱基的含量(Ａ 、Ｔ 、Ｃ 、Ｇ )ꎬ以
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