Page 157 - 《广西植物》2025年第7期

７ 期 蒋琼海等: 秋石斛遗传转化筛选标记基因及筛选剂的筛选 １ ３ ４ ９

Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ￣ｔｙｐｅ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｈｙｂｒｉｄｓ (Ｄｅｎ￣Ｐｈａｌｓ) ａｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ ｐｌａｎｔｓ ｉｎ ｔｒｏｐｉｃａｌ ａｒｅａｓꎬ ｗｉｔｈ
ｕｎｉｑｕｅ ｆｌｏｗｅｒ ｓｈａｐｅｓ ａｎｄ ｒｉｃｈ ｃｏｌｏｒｓꎬ ａｎｄ ｈａｖｅ ｅｘｔｒｅｍｅｌｙ ｈｉｇｈ ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ ｖａｌｕｅ ｉｎ ｆｌｏｗｅｒ ｍａｒｋｅｔ. Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｒｅｅｄｉｎｇ ｉｓ ａｎ
ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｍｅａｎｓ ｔｏ ｂｒｅａｋ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ ｂｒｅｅｄｉｎｇꎬ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅｓ ａｓｓｉｓｔｅｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｃａｎ ａｃｃｅｌｅｒａｔｅ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｒｏｃｅｓｓ. Ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｏｂｔａｉｎ ｓｕｉｔａｂｌｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ａｇｅｎｔｓ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ
Ｄｅｎ￣Ｐｈａｌｓꎬ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｔｏｏｋ ｔｈｅ ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｉｃ ｃａｌｌｕｓｅｓ ( ＥＣｓ) ａｎｄ ｐｒｏｔｏｃｏｒｍｓ ｏｆ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ‘ Ｓｏｎｉａ Ｈｉａｓａｋｕｌ’ ａｎｄ
Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ‘Ｎｏｂｉｌｅ Ｌｉｎｄｌ.’ ａｓ ｅｘｐｌａｎｔｓꎬ ａｎｄ ｐｌａｃｅｄ ｔｈｅｍ ｏｎ ｍｅｄｉａ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｋａｎａｍｙｃｉｎꎬ
ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ (Ｇ４１８)ꎬ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｂｉａｌａｐｈｏｓ ｔｏ ｔｅｓｔ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔｓꎬ ｏｂｓｅｒｖｅ
ｔｈｅｉｒ ｇｒｏｗｔｈ ｓｔａｔｕｓꎬ ａｎｄ ｃａｌｃｕｌａｔｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅｓ. Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅꎬ ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｗｅｒｅ ａｓ ｆｏｌｌｏｗｓ: (１) Ｔｈｅ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｔｗｏ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｈａｄ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ
ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔｓꎬ ｔｈａｔ ｉｓꎬ ｔｈｅｙ ｗｅｒｅ ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎꎬ Ｇ４１８ꎬ ｂｉａｌａｐｈｏｓꎬ ｂｕｔ
￣１
ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏ ｋａｎａｍｙｃｉｎ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｓｔｉｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｎｏｒｍａｌｌｙ ｉｎ ｔｈｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｅｄｉｕｍ ｗｉｔｈ ａ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ７００ ｍｇＬ .
￣１
(２) Ｔｈｅ ｌｅｔｈａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎꎬ Ｇ４１８ ａｎｄ ｂｉａｌａｐｈｏｓ ｔｏ ｅｘｐｌａｎｔｓ ｗｅｒｅ ３０ꎬ ５０ꎬ ７ ｍｇＬ ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
(３) Ｕｓｉｎｇ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎ ａｓ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ ａｎｄ ｈｐｔ ａｓ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅꎬ ｔｈｅ ｉｎｉｔｉａｌ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ３０
￣１
ｍｇＬ ｗａｓ ｏｐｔｉｍａｌꎬ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｃｙｃｌｅ ｅｘｔｅｎｄｅｄꎬ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｗａｓ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ
ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｌｉｎｅｓ. Ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｈａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｍｉｎｉｍｕｍ ｌｅｔｈａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｗｏ ｖａｒｉｅｔｉｅｓ ｏｆ
Ｄｅｎ￣Ｐｈａｌｓ ｔｏ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔｓꎻ ｈｐｔꎬ ｎｐｔꎬ ａｎｄ ｂａｒ ｃａｎ ａｌｌ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅｓ ｆｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ
ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍｓ ｏｆ Ｄｅｎ￣Ｐｈａｌｓꎬ ｗｉｔｈ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔｓ ａｒｅ ｈｙｇｒｏｍｙｃｉｎꎬ Ｇ４１８ꎬ ａｎｄ ｂｉａｌａｐｈｏｓꎬ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｄｕｒｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓꎬ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｇｒａｄｉｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ
ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｉｓ ｂｅｎｅｆｉｃｉａｌ ｆｏｒ ｏｂｔａｉｎｉｎｇ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｅｘｐｌａｎｔｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ￣ｔｙｐｅ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｈｙｂｒｉｄｓꎬ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ ｇｅｎｅꎬ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ａｇｅｎｔꎬ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎꎬ
ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ

秋 石 斛 ( Ｐｈａｌａｅｎｏｐｓｉｓ￣ｔｙｐｅ Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ ｈｙｂｒｉｄｓꎬ 体系之前ꎬ有必要对不同筛选剂进行敏感性测试ꎮ
Ｄｅｎ￣Ｐｈａｌｓ ) 是 兰 科 第 二 大 属———石 斛 属 石斛兰遗传转化研究中常用的筛选标记基因有新
(Ｄｅｎｄｒｏｂｉｕｍ)中观赏性极高的盆栽与切花兼用型花 霉素磷酸转移酶基因( ｎｐｔ)、潮霉素磷酸转移酶基
卉ꎮ 其商业化品种选育主要依赖于传统育种ꎬ受资 因(ｈｐｔ)和草丁膦乙酰转移酶基因( ｂａｒ) ( Ｋｎａｐｐ ｅｔ
源遗传背景限制ꎬ难以获得较大突破ꎬ如花色、花 ａｌ.ꎬ ２０００ꎻＣｈａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７)ꎮ ｎｐｔ 赋予转基因植物

香、花型、抗逆、抗寒定向改良(Ｋｉｓｈｉ￣Ｋａｂｏｓｈｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ 多种氨基糖苷类抗生素抗性ꎬ如卡那霉素、新霉素
２０１８)ꎮ 相比之下ꎬ利用分子育种技术不仅可以加 和 Ｇ４１８(Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＆ Ｒｕｄａｓꎬ ２０２３)ꎬ其中卡那霉

速新种质创制ꎬ 还可以实现精准育种 ( Ｘｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ 素是石斛兰遗传转化对应 ｎｐｔ 基因最常用的筛选
２０１９ꎻＺｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２ꎻＬｉ Ｙ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２)ꎮ 石斛兰 剂(ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６ａ)ꎮ 然而ꎬ兰科植物对卡
转基因研究虽然已经有几十年历史ꎬ但转化周期 那霉素具有天然的抗性ꎬ需要较高的剂量才能获
长、转化效率低、转基因植株嵌合率高仍是限制该 得转基因株系ꎮ 虽然卡那霉素相较于其他筛选剂
技术广泛应用的主要因素(ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６ａꎻ 成本较低ꎬ但其筛选过程更容易获得嵌合体ꎬ不仅
Ｏｖｃｈａｒｅｎｋｏ ＆ Ｒｕｄａｓꎬ ２０２３)ꎮ 目前ꎬ我国石斛兰分 耗时且费力( Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７)ꎮ ｈｐｔ 是石斛兰遗
子育种研究主要集中在药用铁皮石斛、流苏石斛 传转化研究中应用最多的筛选标记基因ꎬ因为石
和金钗石斛ꎬ尚未见到关于秋石斛分子育种的报 斛兰对潮霉素敏感ꎬ低浓度即可以完全抑制非转
道(Ｍｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００３ꎻ崔波等ꎬ２０１５ꎻ黄超群等ꎬ２０１８)ꎮ 化株系的生长ꎬ所以该筛选剂除了贵并没有太大缺
在遗传转化研究中应用筛选标记基因或报告 点(ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１６ａ)ꎮ ｂａｒ 基因编码草丁膦乙
基因辅助筛选可以显著地提高转化效率和节约时 酰转移酶ꎬ对草铵膦和双丙氨膦均具有抗性ꎬ转化
间成本ꎮ 石斛兰已报道的品种超过 １ ５００ 个ꎬ不同 该基因不仅可以实现转化植株的抗性筛选ꎬ还可以
基因型对 筛 选 剂 的 敏 感 性 存 在 差 异 ( ｄａ Ｓｉｌｖａ ｅｔ 赋予转基因植株除草剂抗性ꎬ因此在石斛兰中也有
ａｌ.ꎬ ２０１６ａꎬ ｂ)ꎮ 因此ꎬ在构建本地品种遗传转化 应用报道(Ｃｈａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７ꎻＤｉｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１３)ꎮ