Page 158 - 《广西植物》2025年第7期
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１ ３ ５ ０ 广 西 植 物 ４５ 卷
受基因型限制ꎬ秋石斛对不同筛选剂必然具 筛选剂ꎬ倒入直径 ９０ ｍｍ 培养皿ꎮ
有共性与特性ꎮ 本研究以秋石斛‘ 三亚阳光’ 和 １.２ 试验方法
‘诺贝尔’胚性愈伤组织和原球茎为外植体ꎬ通过 １.２.１ 胚性愈伤组织对不同抗生素及除草剂的敏
设置不同筛选剂浓度梯度ꎬ测试 ２ 种外植体对不 感性测试 将生长 ２０ ｄ 且状态一致的胚性愈伤组
同筛选剂的敏感性ꎬ拟探讨:(１) 秋石斛遗传转化 织接 种 到 含 有 不 同 浓 度 卡 那 霉 素、 遗 传 霉 素
研究可以使用的筛选标记基因ꎻ(２) 筛选标记基因 (Ｇ４１８)、潮霉素和双丙氨膦胚性愈伤组织增殖培
对应的最佳筛选剂及筛选浓度ꎻ(３) 进一步以胚性 养基中ꎬ 设 置 卡 那 霉 素 浓 度 梯 度 为 ０、１００、３００、
愈伤 组 织 为 外 植 体ꎬ 用 携 带 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３ 的 ５００、７００、９００ ｍｇ Ｌ ꎬ Ｇ４１８ 浓 度 梯 度 为 ０、５０、
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ＥＨＡ１０５ 菌株进行遗传转化测试ꎬ探索筛选剂使用 １００、２００、３００、４００ ｍｇＬ ꎬ潮霉素浓度梯度为 ０、
的最佳筛选方案ꎮ 本研究将为秋石斛高效遗传转 １０、３０、５０、７０、９０ ｍｇＬ 和双丙氨膦浓度梯度为
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化体系的建立及基因工程育种奠定基础ꎮ ０、１、３、５、７、９ ｍｇＬ ꎬ每周观察胚性愈伤组织是
否褐化、变软ꎬ４ 周后统计存活率ꎮ 每种处理浓度
１ 材料与方法 接种 ４ 板ꎬ每板 １５ 个胚性愈伤组织ꎬ共 ６０ 个ꎬ设置
３ 个重复ꎬ培养温度为(２５±２)℃ ꎬ暗培养ꎬ相对湿
１.１ 试验材料 度为 ７０％ ~ ８０％ꎮ
本研究的供试植物外植体为继代 ２０ ｄ 的胚性 １.２.２ 原球茎对不同抗生素及除草剂的敏感性测
愈伤组织和播种 ２ 个月的原球茎ꎻ转化外植体为 试 与胚性愈伤组织对不同抗生素和除草剂的敏
预培养 １ ~ ２ 周的胚性愈伤组织ꎻ转化菌株为携带 感性实验一致ꎬ将播种 ２ 个月的原球茎接种到含
ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３ 的 ＥＨＡ１０５ 菌株ꎬ质粒图谱如图 １ 有不同浓度梯度抗生素和除草剂的原球茎分化培
所示ꎮ 养基中ꎮ 每个品种每个处理各接种 ５ 板ꎬ每板放
药品 Ｇ４１８ 购自上海麦克林生化科技有限公 置 １２ 个ꎬ共 ６０ 个原球茎ꎬ设置 ３ 个重复ꎮ 在光周
司ꎻ双丙氨膦购自 Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ 股份有限公 期为 １２ ｈ、温度(２５ ± ２)℃ 条件下培养ꎬ每周观察
司ꎻ羧苄青霉素( Ｃａｒｂ)、乙酰丁香酮( ＡＳ) 和卡那 １ 次ꎬ４ 周后根据原球茎是否为绿色统计存活率ꎮ
霉素购自北京索莱宝有限公司ꎻ潮霉素购自赛国 １.２.３ 胚性愈伤组织遗传转化测试 农杆菌介导
生物科技有限公司ꎻ植物生长调节剂 ２ꎬ４￣Ｄ、ＫＴ 秋石斛胚性愈伤组织遗传转化方法参考铁皮石斛
(Ｋｉｎｅｔｉｎ)、ＩＢＡ 和琼脂购自 Ｓｉｇｍａ 生物公司ꎻＭＳ 培 遗 传 转 化 体 系 ( Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１８ )ꎬ 将 携 带
养基(不含糖和琼脂)购自北京酷莱博生物科技有 ｐＣＡＭＢＩＡ１３０３ 的农杆菌 ＥＨＡ１０５ 悬浮至 ＯＤ 值
６００
限公司ꎻ葡萄糖和蔗糖购自西陇科学股份有限公 为 ０.５ ~ ０.８ꎬ侵染胚性愈伤组织 ２０ ｍｉｎꎻ将胚性愈
司ꎻ花宝 １ 号购自台和园艺企业股份有限公司ꎮ 伤组织转入含无菌滤纸的平皿中ꎬ在超净工作台
￣１ 中吹干(约 ０.５ ｈ)ꎻ转入共培养基中暗培养 ２ ｄꎬ温
胚性愈伤组织增殖培养基为 ＭＳ ＋ ３０ ｇＬ
￣１ ￣１ 度 ２１ ~ ２３ ℃ 、相对湿度 ７０％ꎻ转入筛选培养基进行
葡萄糖 ＋ １ ｇＬ 花宝 １ 号 ＋ ８ ｇＬ 琼脂 ＋ ０.５
ｍｇＬ ＩＢＡ ＋ ０.５ ｍｇＬ ＫＴꎬｐＨ ＝ ５.８ꎻ原球茎分 １ 个月为 １ 个周期的筛选ꎬ培养条件为(２５ ± ２)℃
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￣１ ￣１ 暗培养ꎮ １ ~ ３ 个月后进行 ＧＵＳ 染色ꎬ检测遗传转
化培养基为 １ / ２ＭＳ ＋ ３０ ｇＬ 葡萄糖 ＋ ８ ｇＬ
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琼脂 ＋ ０.５ ｍｇＬ ＩＢＡ ＋ ０.１５ ｍｇＬ ＫＴꎬｐＨ ＝ 化效果ꎮ
￣１ １.３ 数据分析
５.８ꎻ胚性愈伤组织筛选培养基为 ＭＳ ＋ ３０ ｇＬ
￣１ ￣１ 数据处理采用 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ９ 作图并进行
葡萄糖 ＋ １ ｇＬ 花宝 １ 号＋ ８ ｇＬ 琼脂 ＋ ０.５
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ｍｇＬ ＩＢＡ ＋ ０.５ ｍｇＬ ＫＴ ＋ ５００ ｍｇＬ Ｃａｒｂ ＋ 显著性分析ꎮ 胚性愈伤组织存活率(％) ＝ ( 淡黄
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３０ / ５０ / ８０ ｍｇＬ 潮霉素ꎬｐＨ ＝ ５.８ꎻ侵染液为 ＭＳ ＋ 脆嫩胚性愈伤组织数 / 每个处理总胚性愈伤组织
３０ ｇＬ 蔗糖 ＋ １００ μｍｏｌＬ ＡＳꎬｐＨ ＝ ５.２ꎻ共培 数) ×１００ꎻ原球茎存活率(％)＝ ( 绿色类原球茎数 /
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养基为 ＭＳ ＋ ３０ ｇＬ 葡萄糖 ＋ １ ｇＬ 花宝 １ 号 ＋ 每个处理总原球茎数) ×１００ꎻ胚性愈伤组织褐化率
￣１ ￣１ ￣１ (％)＝ (胚性愈伤组织褐化数 / 每个处理总胚性愈
８ ｇＬ 琼脂 ＋ ０.１ ｍｇＬ ２ꎬ４￣Ｄ ＋ ０.１ ｍｇＬ
￣１ 伤组织数) × １００ꎻ标准误利用 Ｅｘｃｅｌ 计算ꎬ即百分
ＫＴ＋１００ μｍｏｌＬ ＡＳꎬｐＨ ＝ ５.２ꎻ所有的培养基 １２１
℃ 灭菌 ２０ ｍｉｎꎬ待培养基温度降至约 ５０ ℃ 时加入 比的平均值±标准误ꎮ
