Page 80 - 《广西植物》2025年第7期

１ ２ ７ ２ 广 西 植 物 ４５ 卷
进行全长转录组测序ꎬ通过生物信息学软件进行 的 ｃＤＮＡ 总量ꎻ对全长 ｃＤＮＡ 进行损伤修复、末端
组装和注释ꎬ拟探讨以下问题:(１) 获取高质量全 修复、连接 ＳＭＲＴ 哑铃型接头ꎬ构建全长转录组文
长转录本进行分析和功能注释ꎻ(２) 刺梨黄酮类化 库ꎻ使用核酸外切酶消化ꎬ去除 ｃＤＮＡ 两端未连接
合物生物合成途径中相关基因的挖掘ꎻ(３) 调节黄 接头的序列ꎻ结合引物、绑定 ＤＮＡ 聚合酶ꎬ形成完
酮类化合物合成的潜在转录因子挖掘ꎮ 本研究丰 整的 ＳＭＲＴ ｂｅｌｌ 文库ꎮ 通过库检合格后ꎬ按照目标
富了刺梨基因数据库ꎬ以期为参与刺梨黄酮类化 下机数据量( 合同约定测序数据量 ３０ Ｇ)ꎬ使用
合物生物合成途径中关键功能基因的筛选奠定 ＰａｃＢｉｏ 测序仪进行全长转录组测序ꎮ

基础ꎮ １.４ 数据处理
得到三代下机数据后使用 ＰａｃＢｉｏ 官方软件包
１ 材料与方法 ＳＭＲＴｌｉｎｋ(ｖ１２.０.０) 来处理原始下机数据( 参数

ｍｉｎ＿ｐａｓｓｅｓ ３ꎻ ｍｉｎ＿ｌｅｎｇｔｈ ５０ꎻ ｍａｘ＿ｌｅｎｇｔｈ １５０００):
１.１ 材料 首先ꎬ对单分子测序序列 Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｒｅａｄｓ 去掉接

人工栽培的刺梨品种有‘ 贵农 １ 号’ ‘ 贵农 ２ 头 ( ａｄａｐｔｅｒ) 序 列 后ꎬ 得 到 Ｓｕｂｒｅａｄｓꎻ 其 次ꎬ 使 用
号’‘ 贵 农 ５ 号’ 和 ‘ 贵 农 ７ 号’ꎮ 其 中ꎬ ‘ 贵 农 ５ ＬｏＲＤＥＣ (ｖ０. ９) 软 件 将 Ｓｕｂｒｅａｄｓ 进 行 自 我 纠 错
号’具有强大的栽培适应性及更大、更重、更高产 (参数 ｋ ２１ꎻ ｓ ３)ꎬ得到环状一致性序列 ( ｃｉｒｃｕｌａｒ
的果实ꎬ果汁色差小且含有更丰富的可溶性固体 ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎬＣＣＳ)ꎬ检查 ＣＣＳ 是否包含 ５′、
物质和单宁( Ｌｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２４)ꎬ具有显著的经济回 ３′端引物和 ｐｏｌｙＡ 尾及其位置关系ꎬ将 ＣＣＳ 分成三
报率( Ｌｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１７)ꎮ 测序用的‘ 贵农 ５ 号’ 刺 类ꎬ即 全 长 ( ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈꎬ ＦＬ) 序 列、 全 长 非 嵌 合
梨采自贵州省六盘水市钟山区明湖国家湿地公园 ( ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｎｏｎ￣ｃｏｎｃａｔｅｍｅｒꎬ ＦＬＮＣ ) 序 列 和 具 有
(１０４°８０′５２″ Ｅ、２６°５７′９９″ Ｎ)ꎮ 于 ２０２３ 年 ４ 月选 ｐｏｌｙＡ 的全长非嵌合( ＦＬＮＣ￣ｐｏｌｙＡ) 序列ꎻ然后ꎬ利
择长势株型较一致的 １５ 株刺梨为供试材料( 每 ５ 用 ＳＭＲＴｌｉｎｋ 软件对 ＦＬＮＣ 序列进行聚类去冗余ꎬ
株 １ 组ꎬ共 ３ 组生物学重复)ꎮ 从 ２０２３ 年 ４—９ 月 得到非 冗 余 的 Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ 序 列 集 合ꎬ 进 一 步 利 用
按时间先后分别采集了花、叶、茎、嫩皮、老皮和果 ＳＭＲＴｌｉｎｋ 软 件 中 的 ａｒｒｏｗ 算 法 对 得 到 的 非 冗 余
共 ６ 种组织的样品ꎬ每次取样后立即放入液氮急 Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ 序列进行校正ꎬ得到 Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ
速冷冻ꎬ带回实验室后存于－８０ ℃ 冰箱备用ꎮ 数据ꎻ 最 后ꎬ 利 用 Ｃｄ￣ｈｉｔ 软 件 ( ｖ４. ８. １ ) ( Ｌｉ ＆
１.２ ＲＮＡ 提取与检测 Ｇｏｄｚｉｋꎬ ２００６)进行聚类去冗余(参数 ｃ ０.９９ꎻ Ｇ ０ꎻ
刺梨 ６ 种组织样品的总 ＲＮＡ 提取参考刘林娅 ａＬ ０.９０ꎻ ＡＬ １００ꎻ ａＳ ０.９９ꎻ ＡＳ ３０)ꎬ得到 ｉｓｏｆｏｒｍｓꎮ
等(２０２０)的实验方案进行ꎮ 提取的总 ＲＮＡ 样品 １.５ 生物信息学分析
先经琼脂糖凝胶电泳分析ꎬ检验后总 ＲＮＡ 无降解 生物信息分析流程图 １ 所示ꎮ
及 污 染 后 采 用 Ｎａｎｏｄｒｏｐ 检 测 ＲＮＡ 的 纯 度 １.５. １ 功 能 注 释 将 去 冗 余 后 的 转 录 本 使 用
(ＯＤ )、浓度、核酸吸收峰是否正常ꎬ所有样品 ＤＩＡＭＯＮＤ ＢＬＡＳＴＸ 软件 (ｖ２.０.９)(Ｂｕｃｈｆｉｎｋ ｅｔ ａｌ.ꎬ
２６０/ ２８０
均满足单次建库要求( ＲＮＡ 总量为 １ μｇꎬ浓度≥ ２０１５)与 ＫＥＧＧ、Ｎｒ、Ｓｗｉｓｓ￣Ｐｒｏｔ、ＴｒＥＭＢＬ、ＫＯＧ、ＧＯ、
￣１ 为 １.８ ~ ２.２)ꎮ 随即将所有 ￣５
２００ ｎｇμＬ ꎬＯＤ Ｐｆａｍ 数据库进行比对( 参数:ｅ￣ｖａｌｕｅ ＝ １ × １０ )ꎬ
２６０/ ２８０
样品置于干冰中寄送武汉迈特维尔生物科技有限 得到数据库注释信息ꎻ将 Ｕｎｉｇｅｎｅ 对应的氨基酸序
公司ꎬ公司采用 Ａｇｉｌｅｎｔ ２１００ 精确检测 ＲＮＡ 的完 列使用 ＨＭＭＥＲ 软件 ( ｖ３.３.２) 与 Ｐｆａｍ 数据库比
整性ꎬ并采用 Ｑｕｂｉｔ 对 ＲＮＡ 浓度进行精确定量ꎮ 对(参数:ｅ￣ｖａｌｕｅ ＝ ０.０１)ꎬ得到蛋白结构域的注释
１.３ 文库构建和上机测序 结果ꎮ
将公司进一步检测合格后的 ＲＮＡ 样品进行文 使用 ｉＴＡＫ 软件 (ｖ１.７ａ) 对三代转录本去冗余

库构建和测序ꎮ 全长转录组文库构建使用 Ｏｌｉｇｏ 后得到的 Ｕｎｉｇｅｎｅ 序列进行转录因子预测(默认参
(ｄＴ ) 磁 珠 富 集 含 有 ｐｏｌｙＡ 的 ｍＲＮＡꎬ 使 用 数)ꎮ
ＳＭＡＲＴｅｒ ＰＣＲ ｃＤＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ 将 ｍＲＮＡ 反转录 １.５. ２ 结 构 分 析 对 去 冗 余 后 的 转 录 本 使 用
为 ｃＤＮＡꎻ使用 ＰＣＲ 技术扩增富集合成的 ｃＤＮＡꎬ ＴｒａｎｓＤｅｃｏｄｅｒ 软件 (ｖ５.３.０) 对三代去冗余后得到
利用磁珠筛选片段进行大规模 ＰＣＲꎬ以获得足够 的转录本进行 ＣＤＳ 预测(参数:ｓｉｎｇｌｅ＿ｂｅｓｔ＿ｏｎｌｙ)ꎬ