Page 112 - 《广西植物》2025年第8期

１ ４ ７ ８ 广 西 植 物 ４５ 卷
悬细胞核ꎮ
１.３ 细胞核提取质量检验 ２ 结果与分析
１.３.１ 流式细胞仪分析 取 １.２.２ 中使用 ６ 种提取
液提取 ０.５ ｇ ＰａＶⅢ细胞系 ＰＥＭ 重悬的细胞核ꎬ经 ２.１ 欧洲云杉胚性细胞系形态观察
５０ μｇｍＬ 碘化丙啶( ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ ｉｏｄｉｄｅꎬＰＩ) 孵育 欧洲云杉 ＰＥＭ 为半透明多细胞组织( 图 １:
￣１
１５ ｍｉｎꎬＰＢＳ 缓冲液清洗ꎬ再使用流式细胞仪( ＢＤ Ａ)ꎬ随增殖时间延长ꎬ细胞组织开始出现黄褐色ꎮ
ＦＡＣＳｃａｎｓꎬ德国) 上机检测经 ＰＩ 染色的颗粒ꎮ 采 光学显微镜下可以观测到欧洲云杉 ＰＥＭ 中主要
用 ４８８ ｎｍ 荧光强度激发ꎬ５８０ ｎｍ 荧光强度开始检 包含两类形态完全不同的细胞( 图 １:ＢꎬＣ):小而
测ꎬ６１０ ｎｍ 的荧光强度来确定 ＤＮＡ 分布ꎬ以检测 细胞质致密的细胞通常称为分生细胞( ｍｅｒｉｓｔｅｍ
细胞核数量与质量ꎮ 提取得到细胞核数量多、细 ｃｅｌｌ)ꎬ大而高度液泡化的细胞通常称为液泡细胞

胞碎片少的提取液为最优提取液ꎮ (ｖｅｓｉｃｕｌａｔｅｄ ｃｅｌｌ)ꎮ 大部分胚性细胞不具有明显的
为检验最优提取液对不同基因型细胞系的适 组织形态结构( 图 １:Ｂ)ꎬ但也可以观察到少量的
用性ꎬ取 ２ ｇ ＰａＶⅢ、ＰＩ３ 和 ＰＩ５ 细胞系的 ＰＥＭꎬ使 早期体胚样结构(图 １:Ｃ)ꎮ
用最优提取液进行提核ꎬ上流式细胞仪上机检测ꎬ ２.２ 不同细胞核提取液的效果比较
每个细胞系重复 ３ 次ꎮ 使 用 ＬＢ０１、 Ｏｔｔｏｓ、 Ｇａｌｂｒａｉｔｈｓ、 ＧＰＢ、 ＷＰＢ 和
１.３. ２ 数 据 分 析 使 用 ＦｌｏｗＪｏ ＴＭ ｖ１０. ３ ( ＢＤ Ｌｉｆｅ ＴｒｉｓＭｇＣｌ ６ 种细胞核提取液分别处理 ０.５ ｇ 欧
２
Ｓｃｉｅｎｃｅｓ)进行流式细胞仪分析ꎮ 选定前向散射角 洲云杉 ＰＥＭꎬ并使用流式细胞仪分析 ６ 种细胞核
信号(ＦＳＣ) < ４９２ ０００ꎬ 侧 向 散 射 角 信 号 ( ＳＳＣ) < 提取 液 的 提 取 效 率ꎮ 结 果 ( 图 ２) 发 现ꎬ ＰＥＭ 经
５６０ ０００内的荧光信号为总的参与分析的荧光信 ＬＢ０１ 提取液提取ꎬ得到细胞核数量最多ꎬ参与分
号 Ｐ１ 绘制散点图ꎮ 根据荧光信号光电转换形成 析的细胞核数量达 ６ １６９ 个ꎻＯｔｔｏｓ 提取液次之ꎬ为
的电脉冲信号ꎬ圈画出荧光信号聚集区域 Ｐ２ꎬ即为 ５ ００７ 个ꎻＷＰＢ 和 ＴｒｉｓＭｇＣｌ 提取液提取的细胞
２
参与分析信号(Ｐｆｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９５ꎻ Ｌｏｕｒｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ 核数量最少ꎬ分别为 １ ２９０ 个和 １ ３２７ 个ꎻＧＰＢ 和
２００７)ꎮ 根据 ＤＮＡ 分布最大峰值前 Ｐ３ 为细胞核 Ｇａｌｂｒａｉｔｈｓ 的提取效率中等ꎬ分别获得 ３ ６７０ 个和
碎片ꎬ最大峰值至第二峰值 Ｐ４ 为处于细胞周期 ３ ２４５个细胞核ꎮ ＧＰＢ 提取液产生了最多的细胞
Ｇ０ / Ｇ１ 到 Ｇ２ / Ｍ 期 的 细 胞 核 ( Ｄｏｌｅｚｅｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ 核碎片ꎬ流式细胞仪检测获得的完整细胞核不足
２００７)ꎬ计算 Ｇ０ / Ｇ１ 和 Ｇ２ / Ｍ 的细胞核数量及变异 总细胞核的 ５０％ꎻ其他 ５ 种提取液获得的完整细
系数ꎮ 每组提取液运行参数设置一致ꎬ比较分析 胞核占比为 ６５％ ~ ７５％ꎮ 综合考虑细胞核提取效
各种细胞核提取液提取获得的细胞核数量和碎片 率和细胞核的完整性ꎬＬＢ０１ 提取液在保持细胞核
含量ꎬ产生更多单个细胞核和较少细胞核碎片的 完整性的基础上具有最高的细胞核提取效率ꎮ 此
提取液为最优提取液ꎮ 使用 ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ８.０２ 外ꎬ比较 ６ 种提取液 Ｇ０ / Ｇ１ 和 Ｇ２ / Ｍ 的细胞核数
单因素方差分析欧洲云杉 ＰＥＭ 细胞核效率基因 量及其变异系数ꎬ相同质量欧洲云杉 ＰＥＭ 经 ＬＢ０１

型间差异ꎮ 提取液提取到 Ｇ０ / Ｇ１、Ｇ２ / Ｍ 的细胞核数量较多ꎬ
１.４ 细胞核膜完整性检测 ＣＶ 分别为 ５.０％和 ４.４％ꎬ均为 ６ 种提取液中最低
处于增殖阶段的欧洲云杉 ＰａＶⅢ细胞系使用 (表 １)ꎮ 为验证 ＬＢ０１ 提取液提取欧洲云杉胚性
体视显微镜(ＬＥＩＣＡ Ｓ６Ｅꎬ德国) 观测ꎬＰＥＭ 在液体 细胞系的重复性及对不同基因型细胞系的适用
培养基的形态使用光学显微镜( Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１ꎬ日 性ꎬ使用 ＬＢ０１ 提取液提取 ＰａＶⅢ、ＰＩ５ 和 ＰＩ３ ３ 条

本)观测ꎮ ＰＥＭ 取经最优提取液进行细胞核提取ꎬ 不同 ＰＥＭ 的细胞核ꎮ 基因型间 ＰＥＭ 细胞核的提
重悬于 ＰＢＳ(北京酷来搏科技有限公司ꎬ中国)ꎬ使 取效率及细胞碎片的占比之间无显著性差异( 图
用 ＤＡＰＩ[生工生物工程( 上海) 股份有限公司ꎬ中 ３:ＡꎬＢ)ꎬ实验结果稳定ꎮ

国]染色 ５ ｍｉｎꎬ再用 ＰＢＳ 清洗掉附着的多余染料ꎬ ２.３ 欧洲云杉胚性细胞系细胞核的完整性观察
充分稀 释 后 滴 加 到 载 玻 片 上ꎬ 使 用 光 学 显 微 镜 为进 一 步 验 证 细 胞 核 膜 的 完 整 性ꎬ 以 判 断
(Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５１ꎬ日本)细胞核经 ＤＡＰＩ 染色显清晰 ＬＢ０１ 提取液提取欧洲云杉 ＰＥＭ 细胞核的提取效
的蓝色荧光ꎬ由此观测细胞核膜完整性ꎮ 果ꎬ 本试验对获得的细胞核进行了镜检ꎮ 通过明