Page 111 - 《广西植物》2025年第8期
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８ 期 胡继文等: 基于流式细胞仪分析的欧洲云杉原胚团细胞核提取液筛选 １ ４ ７ ７
高ꎬ这使得其细胞核提取方法和流程与其他植物 [生工生物工程( 上海) 股份有限公司ꎬ中国]ꎬ２
组织相比可能有所不同ꎮ 同时ꎬＰＥＭ 可分化发育 ｍｍｏｌＬ Ｎａ ＥＤＴＡ( 北京酷来搏科技有限公司ꎬ
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成完整植株ꎬ是研究植物细胞全能性的重要材料ꎮ 中国) ０.５ ｍｍｏｌＬ 四盐酸精胺[ 生工生物工程
筛选适合欧洲云杉 ＰＥＭ 的细胞核提取方法对于 (上海) 股份有限公司ꎬ中国]ꎬ８０ ｍｍｏｌＬ ＫＣｌ
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开展针叶树细胞全能性研究具有重要意义ꎮ 本研 (北京化工厂ꎬ中国)ꎬ２０ ｍｍｏｌＬ ＮａＣｌ( 北京化
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究以欧洲云杉 ＰＥＭ 为材料ꎬ以机械法 为 基 本 方 工厂ꎬ中国)ꎬ０.１％( Ｖ / Ｖ) ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００[ 生工生物工
法ꎬ提取欧洲云杉 ＰＥＭ 细胞核ꎬ基于流式细胞仪 程(上海)股份有限公司ꎬ中国]ꎬ１５ ｍｍｏｌＬ β￣巯
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分析、组织化学染色显微观测ꎬ比较 ６ 种细胞核提 基乙醇( 上海麦克林生化科技股份有限公司ꎬ中
取液(ＬＢ０１、Ｏｔｔｏｓ、Ｇａｌｂｒａｉｔｈｓ、ＧＰＢ、ＷＰＢ 和 Ｔｒｉｓ 国)ꎬｐＨ 为 ７.０ ~ ８.０ꎬ－２０ ℃ 保存ꎬ使用时解冻ꎬ解
ＭｇＣｌ )的核提取效率ꎬ拟探讨以下问题:(１) 哪种 冻后 ４ ℃ 保存(Ｄｏｌｅｚｅｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２００７)ꎮ
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细胞核提取液提取获得的细胞核数量最多、细胞 (３)ＴｒｉｓＭｇＣｌ :２００ ｍｍｏｌＬ 三(羟甲基)氨
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碎片最少ꎬ该提取液筛选为最适提取液ꎻ(２) 最适 基甲烷ꎬ４ ｍｍｏｌＬ 氯化镁( 北京化工厂ꎬ中国)ꎬ
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提取液在不同细胞系细胞核提取效率稳定性如 ０. ５％ ( Ｖ / Ｖ ) ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬ ｐＨ 为 ７. ５ꎬ ４ ℃ 保 存
何ꎻ(３)最适提取液提取获得的细胞核是否保持较 (Ｐｆｏｓｓｅｒ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９９５)ꎮ
高的核膜完整性ꎮ 本研究以期获得制备针叶树 ( ４ ) Ｇａｌｂｒａｉｔｈｓ: ４５ ｍｍｏｌ Ｌ ￣１ ＭｇＣｌ ꎬ ３０
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ＰＥＭ 组织高纯度、高完整性细胞核悬液的最适提 ｍｍｏｌＬ 柠檬酸钠(北京酷来搏科技有限公司ꎬ中
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取液ꎬ为裸子植物开展单细胞分辨率核遗传物质 国)ꎬ２０ ｍｍｏｌＬ ＭＯＰＳ( 北京酷来搏科技有限公
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转录分析、组织异质性分析、细胞命运决定、发育 司ꎬ中国)ꎬ０.１％(Ｖ / Ｖ) ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬｐＨ 为 ７.０ꎬ－２０
轨迹方向等研究及未来在针叶树基因工程领域中 ℃ 保存ꎬ使用时解冻ꎬ解冻后 ４ ℃ 保存( Ｇａｌｂｒａｉｔｈ ｅｔ
使用细胞核提供研究基础ꎮ ａｌ.ꎬ １９８３)ꎮ
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(５ ) ＧＰＢ: ０. ５ ｍｍｏｌ Ｌ 四 盐 酸 精 胺ꎬ ３０
１ 材料与方法 ｍｍｏｌ Ｌ 柠 檬 酸 钠ꎬ ２０ ｍｍｏｌ Ｌ ￣１ ＭＯＰＳꎬ ８０
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ｍｍｏｌ Ｌ ＫＣｌꎬ ２０ ｍｍｏｌ Ｌ ＮａＣｌꎬ ０. ５％ ( Ｖ / Ｖ)
１.１ 植物材料 ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬｐＨ 为 ７.０ꎬ４ ℃ 保存( Ｌｏｕｒｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ
本研究以欧洲云杉胚性细胞系 ＰａＶⅢ、ＰＩ３、 ２００７)ꎮ
ＰＩ５ 的原胚团(ＰＥＭ)为研究对象ꎮ ＰＥＭ 增殖与保 (６)ＷＰＢ:０.２ ｍｍｏｌＬ ＴｒｉｓＨＣｌ( 北京酷来
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持方法参见 Ｓｕáｒｅｚ 和 Ｂｏｚｈｋｏｖ(２００８)ꎮ 将 ＰＥＭ 置 搏科技有限公司)ꎬ４ ｍｍｏｌＬ 氯化镁ꎬ２ ｍｍｏｌ
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于含有植物生长调节剂的 １ / ２ＬＰ 固体培养基( 添 Ｌ Ｎａ ＥＤＴＡꎬ８６ ｍｍｏｌＬ ＮａＣｌꎬ１０ ｍｍｏｌＬ 焦
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加激素:２. ２ ｍｇＬ ２ꎬ４￣Ｄ、１. １ ｍｇ Ｌ ６￣ＢＡꎻ附 亚硫酸钠(上海麦克林生化科技股份有限公司ꎬ中
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加:１０ ｇＬ 蔗糖、４ ｇＬ 植物凝胶、１ ｇＬ 酶解 国)ꎬ１％ ( Ｖ / Ｖ) ＰＶＰ￣１０ ( Ｓｉｇｍａꎬ美 国)ꎬ１％ ( Ｖ / Ｖ)
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酪蛋白、０.５ ｇＬ 谷氨酰胺) 继代增殖培养ꎬ继代 ＴｒｉｔｏｎＸ￣１００ꎬｐＨ 为 ７.５ꎬ４ ℃ 保存( Ｌｏｕｒｅｉｒｏ ｅｔ ａｌ.ꎬ
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培养环境为 ２５ ℃ ꎬ黑暗条件ꎬ每两周将 ＰＥＭ 继代 ２００７)ꎮ
转移到新鲜培养基ꎮ １.２.２ 细 胞 核 提 取 取 欧 洲 云 杉 ＰａＶ Ⅲ 细 胞 系
１.２ 细胞核提取方法 ＰＥＭ ６ 份ꎬ每份 ０.５ ｇꎬ将其放入直径为 ６０ ｍｍ 培
１.２.１ ６ 种核提取试剂 本研究共采用 ６ 种细胞核 养皿中ꎬ依次加入 １.５ ｍＬ 前述配置的 ６ 种细胞核
提取液ꎬ具体如下ꎮ 提取液ꎮ (１) 破碎细胞:使用一次性刀片将其切
(１)Ｏｔｔｏｓ:Ｏｔｔｏ Ⅰ与 Ｏｔｔｏ Ⅱ按照体积比 ２ ∶ １ 碎ꎬ避免将其切得过于碎ꎬ无明显粘连即可ꎮ (２)
配置ꎮ 其中ꎬＯｔｔｏ Ｉ:１００ ｍｍｏｌＬ 柠檬酸( 北京酷 释放细胞核:冰上提取 ５ ｍｉｎꎬ充分释放细胞核ꎮ
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来搏科技有限公司ꎬ中国)ꎬ０.５％ ( Ｖ / Ｖ) Ｔｗｅｅｎ ２０ (３)除去未切碎的大块植物组织:将提取液过滤至
[生工生物工程( 上海) 股份有限公司ꎬ中国]ꎬｐＨ ３００ 目尼龙网(孔径约为 ４０ μｍ)ꎬ收集ꎮ (４) 除去
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为 ２. ０ ~ ３. ０ꎬ ４ ℃ 保 存ꎻ Ｏｔｔｏ Ⅱ: ４００ ｍｍｏｌ Ｌ 碎片 小 杂 质: 水 平 离 心 机 ( Ｓｉｇｍａ ３Ｋ１５ꎬ 德 国)ꎬ
ＮａＨ ＰＯ ꎬｐＨ 为 ８.０ ~ ９.０(Ｏｔｔｏꎬ １９９０)ꎮ １ ０００ ｇ 转速ꎬ４ ℃ 离心约 ８ ｍｉｎꎬ除去上清液ꎮ (５)
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(２)ＬＢ０１:１５ ｍｍｏｌＬ 三( 羟甲基) 氨基甲烷 制备细胞核悬液:加入 １００ μＬ 的 ＰＢＳ 缓冲液ꎬ重
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