Page 120 - 《广西植物》2020年第9期
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９ 期 金秋珠等: 产壳聚糖酶内生真菌的筛选、鉴定及酶活力初步研究 １ ３ ３ ５
馏水定容至 １ ０００ ｍＬꎬ混匀ꎬ配制成 ４ μｍｏｌｍＬ ￣１ 实验组酶活力相对于空白对照组酶活力的比例即
氨基葡萄糖标准溶液ꎬ置于 ４ ℃ 冰箱中保存备用ꎮ 为添 加 金 属 离 子 后 的 相 对 酶 活 力 ( 高 剑 锋 等ꎬ
１.６.２ 氨基葡萄糖标准曲线绘制 取 ６ 支洗净的 ２０１２)ꎮ 即相对酶活力 ＝ 实验组酶活力 / 空白对照
１０ ｍＬ 试管ꎬ依次加入 ０、０.２、０.４、０.６、０.８、１.０ ｍＬ 组酶活力ꎮ
浓度为 ４ μｍｏｌｍＬ 的氨基葡萄糖标准溶液ꎬ均加 １.９ 菌株 Ｓｔｄｉｆ９￣４ 酶活力稳定性测定
￣１
蒸馏水至 １ ｍＬꎬ再分别加入 １ ｍＬ ＤＮＳ 试剂ꎬ放入 将菌株连续传代培养五代ꎬ分别测定每代菌
１００ ℃ 的水中反应 １０ ｍｉｎ 后取出ꎮ 冷却后ꎬ加蒸 株产壳聚糖酶活力ꎬ以判断菌株产酶活力是否稳
馏水定容至 １０ ｍＬꎬ混匀ꎮ 在 ５２０ ｎｍ 波长处ꎬ以 ０ 定ꎮ 从保种管内挑出 Ｓｔｄｉｆ９￣４ 菌丝进行活化ꎬ作为
号管调节零点ꎬ测定其他号试管溶液的吸光值ꎮ 第一代ꎬ培养 ３ ｄ 即转接至新的 ＰＤＡ 培养基内ꎬ新
重复 ３ 次测量ꎬ计算出每支试管吸光值的平均值ꎮ 转接菌株继续培养 ３ ｄꎬ作为第二代ꎬ再转接ꎬ以此
１.６. ３ ＤＮＳ 法 测 壳 聚 糖 酶 活 力 参 考 胡 远 亮 类推ꎬ至第五代ꎮ
(２００７)和刘 昌 燕 等 ( ２００９) 的 方 法ꎬ 具 体 操 作 如
下:首先ꎬ取 ０.５ ｍＬ 发酵上清液和 ０.５ ｍＬ １％胶体 ２ 结果与分析
壳聚糖溶液ꎬ在 ５０ ℃ 下保温 ６０ ｍｉｎꎮ 然后ꎬ向试
管中加入 １ ｍＬ ＤＮＳ 试剂终止反应ꎬ并转至沸水中 ２.１ 氨基葡萄糖标准曲线方程
反应 １０ ｍｉｎꎬ反应结束后用流动自来水进行降温ꎮ 建立 的 氨 基 葡 萄 糖 标 准 曲 线 方 程 为 ｙ ＝
最后ꎬ向试管中分别加入蒸馏水至每管溶液体积 ０.１６４ １ｘ－０.００３ ３(Ｒ ＝ ０.９９９ １)ꎬ其中 ｘ 为氨基葡
２
为 １０ ｍＬꎮ 以煮沸失活的酶液作为对照ꎬ用分光光 萄糖浓度ꎬｙ 为不同浓度的氨基葡萄糖溶液的吸
度计测量 ５２０ ｎｍ 处的吸光值( ＯＤ )ꎬ根据氨基 光值ꎮ
５２０
葡萄糖标准曲线方程计算出其对应的氨基葡萄糖 ２.２ 产壳聚糖酶内生真菌筛选
浓度ꎮ 按照以下公式计算酶活力:酶活力 ＝ ( 测定 利用透明圈法ꎬ通过大量筛选ꎬ初步确定透明
样组的还原糖量－对照样组的还原糖量) ×２( 稀释 圈直径 / 菌落直径较大的 ２ 株内生真菌 Ｓｔｄｉｆ９ 和
倍数) / ６０(时间)ꎮ 酶活力定义为每毫升发酵液每 Ｓｔｄｉｆ９￣４(均分离自血散薯块根)为产壳聚糖酶较好
分钟产生 １ μｍｏｌ 还原糖所需的酶量为一个酶活力 的菌 株ꎮ 进 一 步 测 定 ２ 株 内 生 真 菌 Ｓｔｄｉｆ９ 和
单位(Ｕ)ꎮ Ｓｔｄｉｆ９￣４ 发酵液( 培养 ３ ｄ) 的壳聚糖酶活力ꎬ结果
１.７ 菌株 Ｓｔｄｉｆ９￣４ 产酶曲线测定 如表 １ 所示ꎮ 发酵培养 ３ ｄ 的内生真菌 Ｓｔｄｉｆ９ 和
参照毛贵珠等(２０１２) 的方法ꎬ并进行适当改 Ｓｔｄｉｆ９￣４ 对 ９５％脱乙酰度壳聚糖有较好的酶解作
良ꎬ按照 １.４.２ 的操作方法ꎬ将种子液接入 ２５０ ｍＬ 用ꎬ其壳聚糖酶活力分别达到 ０.７８０ 和 ０.９６８ Ｕ
三角瓶中ꎬ每菌接 ３ 瓶ꎬ２８ ℃ 、１５０ ｒｍｉｎ 振荡培 ｍＬ ꎬ Ｓｔｄｉｆ９￣４ 壳 聚 糖 酶 活 力 显 著 高 于 菌 株
￣１
￣１
养ꎬ分 别 于 ２４、 ４８、 ７２、 ９６、 １２０ ｈ 取 发 酵 液 离 心 Ｓｔｄｉｆ９的ꎮ
(４ ０００ ｒｍｉｎ ꎬ１５ ｍｉｎ)ꎬ按照 １.６.３ 方法测定上 ２.３ ２ 株内生真菌产壳聚糖酶活力曲线
￣１
清液酶活力ꎮ 分别测定内生真菌 Ｓｔｄｉｆ９ 和 Ｓｔｄｉｆ９￣４ 在 摇 培
１.８ 金属离子对菌株 Ｓｔｄｉｆ９￣４ 酶活力的影响 ２４、４８、７２、９６、１２０、１４４、１６８ ｈ 后的产酶活力ꎬ以确
分别配制浓度为 １００ ｍｍｏｌＬ 的金属离子 定其产壳聚糖酶活力最佳培养时间ꎬ结果如图 １
￣１
＋ ＋ ＋ ２＋ ２＋ ２＋ ２＋ ２＋ ３＋
(Ｎａ 、Ｋ 、Ａｇ 、Ｃａ 、Ｍｎ 、Ｚｎ 、Ｃｄ 、Ｂａ 和 Ｆｅ ) 所示ꎮ ２ 株内生真菌在前 ７２ ｈ 产酶活力均较低ꎬ
溶液ꎬ然后分别向混有 ０.５ ｍＬ 发酵上清液和 ０.５ ７２ ｈ 后产酶活力迅速增加ꎬ并均在 ９６ ｈ 时产酶活
ｍＬ １％胶体壳聚糖溶液的试管中加入上述金属离 力达到最大值ꎬ９６ ｈ 之后产酶活力开始逐渐降低ꎮ
子溶液 ０.１ ｍＬꎮ 按照 １.６.３ 的方法测定酶活力ꎬ每 从酶活力曲线可知ꎬ在不同的培养时间段ꎬＳｔｄｉｆ９￣４
个样品做 ３ 个平行实验ꎮ 以不加金属离子的空白 菌株 产 酶 活 力 均 高 于 Ｓｔｄｉｆ９ꎮ 因 此ꎬ 后 续 选 取
对照组酶活力为 １００％ꎬ在金属离子存在条件下的 Ｓｔｄｉｆ９￣４ 进行进一步研究ꎮ
