Page 119 - 《广西植物》2020年第9期
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１ ３ ３ ４ 广 西 植 物 ４０ 卷
１.４ 产壳聚糖酶菌株筛选
１ 材料与方法 １.４.１ 初筛(透明圈法筛选) 在超净工作台中ꎬ用
无菌打孔器(直径 ４ ｍｍ) 在已活化的内生真菌菌
１.１ 植物内生真菌 落边缘取菌饼ꎬ转接至初筛培养基平板上ꎬ每皿接
１２２ 株植物内生真菌为广西师范大学珍稀濒 １ 块菌饼ꎬ设置 ３ 个重复ꎬ于 ２８ ℃ 培养ꎬ每天观察
危动植物生态与环境保护教育部重点实验室化学 菌株生长情况ꎬ并在有透明圈产生时ꎬ采用十字交
生态实验室前期从健康柑橘( Ｃｉｔｒｕｓ ｓｐｐ.) 和血散 叉法测量相应透明圈直径(Ｄ) 和菌落直径( ｄ)ꎬ记
薯( Ｓｔｅｐｈａｎｉａ ｄｉｅｌｓｉａｎａ) 植株中分离得到ꎮ 柑橘样 录数据并拍照ꎬ计算 Ｄ / ｄ 比值ꎮ 挑选产透明圈明
品采 自 广 西 桂 林 ( １１０° １９′４４″ Ｅ、 ２５° １６′ １３″ Ｎꎬ 显的菌株ꎬ进一步摇培发酵检测酶活ꎮ
１１０°１６′３６″ Ｅ、２５° １１′５″ Ｎ)、 梧 州 ( １１１° １′１８″ Ｅ、 １.４.２ 复筛 在超净工作台中ꎬ向装有 １００ ｍＬ 种
２３°２９′４６″ Ｎ)ꎻ血散薯采自广西来宾市金秀瑶族自 子培养基的三角瓶(２５０ ｍＬ)中转接 ３ 块活化的菌
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治县(１０９°５９′３４″ Ｅ、２４°１６′１０″ Ｎ)ꎮ 饼ꎬ设置 ３ 个重复ꎬ２８ ℃ 、１５０ ｒｍｉｎ 振荡培养 ３
１.２ 仪器和试剂 ｄꎬ获得种子液ꎮ 用移液枪吸取 ２ ｍＬ 种子液接入
主要仪器:超净工作台 ＺＨＪＨ￣Ｃ１１１２Ｃꎬ上海智 装有 １００ ｍＬ 复筛培养基的三角瓶(２５０ ｍＬ)中ꎬ设
城ꎻ恒温 培 养 箱ꎬ 韶 关 泰 宏 医 疗 器 械ꎻ 恒 温 摇 床 置 ３ 个重复ꎬ２８ ℃ 、１５０ ｒｍｉｎ 振荡培养 ３ ｄ 后ꎬ
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ＬＹＺ￣２１０２Ｃꎬ上海龙跃ꎻ生物显微镜 ＤＭ３ ０００ꎬ德国 测定壳聚糖酶活力ꎮ
徕卡ꎻ紫外可见光分光光度计 ＵＶ￣１ ２００ꎬ上海美普 １.５ 菌株鉴定
达ꎮ 主要药品试剂:ＤＮＳ 试剂(购自优品实验室)ꎬ 采用形态学结合分子生物学的方法对产壳聚
壳聚糖(分子量 ２９ 万ꎬ脱乙酰度 ９５％ꎬ购自浙江玉 糖酶的菌株进行鉴定ꎮ 形态学鉴定菌株主要是通
环澳兴甲壳素有限公司)ꎬ盐酸溶液( 购自西陇科 过不同的培养基(ＣＡ、ＰＤＡ、ＣＹＡ 及 Ｇ２５Ｎ) 对内生
学股份有限公司)ꎬ氢氧化钠( 购自西陇科学股份 真菌进行培养ꎬ参考« 真菌鉴定手册» ( 魏 景 超ꎬ
＋ ＋ １９７９)、«中国真菌志»( 孔华忠ꎬ２００７) 及相关文献
有限公 司)ꎬ 金 属 离 子 盐 ( 所 用 的 离 子 Ｎａ 、 Ｋ 、
Ｃａ 、Ｍｎ 、Ｚｎ 、Ｃｄ 、Ｂａ 和 Ｆｅ 均为氯盐ꎬＡｇ 为 对其进行初步鉴定ꎮ 鉴定特征包括菌落大小、形
３＋
２＋
２＋
＋
２＋
２＋
２＋
ＡｇＮＯ )ꎮ 态、生长速率、边缘特征、菌落及培养基基质颜色ꎬ
３
１.３ 培养基 以及菌落在显微镜下的特征( 如菌丝有无分隔、分
１.３.１ 活化培养基 用于菌种从低温保存条件转 支ꎬ分生孢子形态、大小ꎬ产孢结构特征等)ꎮ 分子
到室温条件的活化适应ꎬ采用马铃薯葡萄糖琼脂 生物学鉴定菌株主要是利用真核生物在 ｒＤＮＡ 的
培养基(ＰＤＡ):去皮的马铃薯 ２０％ꎬ葡萄糖 ２％ꎬ琼 ＩＴＳ 区段具有保守性和特异性序列的特性ꎬ以真菌
脂 ２％ꎬｐＨ ７.０ꎬ１２１ ℃ 高温高压灭菌 ２０ ｍｉｎꎮ 通用引物 ＩＴＳ１ 和 ＩＴＳ４ 扩增菌株 ＩＴＳ 碱基序列ꎬ委
１.３.２ 种子培养基 种子液同 １.３.１ꎬ仅不添加琼脂ꎮ 托北京六合华大基因科技有限公司武汉分公司进
１.３.３ 产 壳 聚 糖 酶 菌 株 筛 选 培 养 基 参 考 张 涛 行检测纯化及测序ꎮ 将获得的测序结果与 ＮＢＣＩ
(２００５)的方法ꎬ配制初筛和复筛诱导培养基ꎮ 数据库中的序列进行 ＢＬＡＳＴ 比对ꎬ选择相似度较
Ａ 组分:１％胶体壳聚糖ꎬｐＨ ５.６ꎮ Ｂ 组分:酵母 高ꎬ亲缘关系近的菌株比对ꎬ并用 ＭＥＧＡ Ⅹ软件ꎬ
粉 ０. １％ꎬ Ｋ ＨＰＯ ３Ｈ Ｏ ０. ３％ꎬ ＫＨ ＰＯ ０. ２％ꎬ 对 ＩＴＳ 碱基序列进行聚类分析ꎬＢｏｏｔｓｔｒａｐ 进行自展
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ＭｇＳＯ ７Ｈ Ｏ ０.１４％ꎬＮａＣｌ ０.１％ꎬＫＣｌ ０.１％ꎬＣａＣｌ 次数为 １ ０００ 的置信度检测ꎬ根据系统发育树中的
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０.０２％ꎬ 琼 脂 ２％ꎮ Ｃ 组 分: 土 豆 汁 ２０％ꎬ 葡 萄 糖 组群关系对菌株进行分类ꎮ
０.２％ꎬ蛋白胨０.５％ꎬ酪蛋白 ０.２％ꎬ酵母浸膏０.５％ꎬ １.６ 壳聚糖酶活力测定
ｐＨ ５.６ꎮ 以上 Ａ、Ｂ、Ｃ 组分均单独灭菌ꎮ 其中ꎬ将 １.６.１ 氨基葡萄糖标准溶液 准确称取 ０.８６３ ｇ 氨
Ａ、Ｂ 两溶液等体积混合制得初筛固体培养基ꎻ将 Ａ、 基葡萄糖盐酸盐(１０５ ℃ 烘至恒重)ꎬ置于小烧杯
Ｃ 两溶液等体积混合制得复筛液体发酵培养基ꎮ 中ꎬ加少量蒸馏水溶解后ꎬ转移到容量瓶中ꎬ用蒸
