Page 118 - 《广西植物》2020年第9期

９ 期 金秋珠等: 产壳聚糖酶内生真菌的筛选、鉴定及酶活力初步研究 １ ３ ３ ３

( １. Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｅｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｒａｒｅ ａｎｄ Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ Ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎꎬ Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００６ꎬ Ｇｕａｎｇｘｉꎬ
Ｃｈｉｎａꎻ ２. Ｇｕａｎｇｘｉ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｒａｒｅ ａｎｄ Ｅｎｄａｎｇｅｒｅｄ Ａｎｉｍａｌ Ｅｃｏｌｏｇｙꎬ Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００６ꎬ Ｇｕａｎｇｘｉꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３. Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ
Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｇｕｉｌｉｎ ５４１００６ꎬ Ｇｕａｎｇｘｉꎬ Ｃｈｉｎａ )

Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ａｒｅ ｇｏｏｄ ｓｏｕｒｃｅｓ ｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｈｉｇｈ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｎｄ ｄｉｓｃｏｖｅｒｉｎｇ ｎｅｗ ｅｎｚｙｍｅｓ. Ｉｎ
ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｓｔｒａｉｎｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ １２２ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｃｉｔｒｕｓ
ａｎｄ Ｓｔｅｐｈａｎｉａ ｄｉｅｌｓｉａｎａꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｔｈｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｗｅｒｅ ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｉｌｙ ｓｔｕｄｉｅｄꎬ ｉｎ ｏｒｄｅｒ ｔｏ ｐｒｏ￣
ｖｉｄｅ ａｎ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ￣ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ
ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅｓ. Ｔｗｏ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉ Ｓｔｄｉｆ９ ａｎｄ Ｓｔｄｉｆ９￣４ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ
ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ｂｙ ｔｒａｎｓｐａｒｅｎｔ ｃｉｒｃｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｌｉｑｕｉｄ ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ. Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｄｉｆ９￣４ (０.９６８ Ｕ
￣１ ￣１
ｍＬ ) ｗａｓ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｈｉｇｈｅｒ ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｏｆ Ｓｔｄｉｆ９ (０.７８０ ＵｍＬ ). Ｓｔｄｉｆ９￣４ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｓｐ. Ｓｔｄｉｆ９￣４ ｂｙ
ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＩＴＳ ｇｅｎｅ. Ｔｈｅ ｆａｃｔｏｒｓ ａｆｆｅｃｔｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ
ｂｙ ＤＮＳ ｒｅａｇｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｒｅａｃｈｅｄ ｍａｘｉｍｕｍ ａｔ ９６ ｈ ｏｆ ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ. Ｉｎ ａｄｄｉ￣
２＋ ２＋ ＋ ２＋ ２＋
ｔｉｏｎꎬ ａｍｏｎｇ ｔｈｅ ｎｉｎｅ ｍｅｔａｌ ｉｏｎｓꎬ Ｍｎ ａｎｄ Ｃａ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ. Ａｇ ꎬ Ｚｎ ꎬ Ｃｄ ꎬ
２＋ ３＋ ＋
Ｂａ ａｎｄ Ｆｅ ｈａｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｎ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ ａｎｄ Ａｇ ｓｈｏｗｅｄ ｍｏｒｅ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｅｆｆｅｃｔꎬ
＋ ＋
ｗｈｉｌｅ Ｋ ａｎｄ Ｎａ ｄｉｄ ｎｏｔ ｓｈｏｗ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ. Ｔｈｅｒｅ ｗａｓ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｅｎｚｙｍｅ
ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｕｒｅｄ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｉｎｄｉｃａｔｅ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｓｔａｂｌｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｐｌａｎｔ ｅｎｄｏｐｈｙｔｉｃ ｆｕｎｇｉꎬ ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅꎬ ｅｎｚｙｍｅ ａｃｔｉｖｉｔｙꎬ Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍꎬ Ｓｔｅｐｈａｎｉａ ｄｉｅｌｓｉａｎａ

自 １９７３ 年 Ｍｏｎａｇｈａｎ ｅｔ ａｌ.(１９７３) 首先报道了 植物体各类组织内而不引起宿主植物产生明显病
壳聚糖酶(ｃｈｉｔｏｓａｎａｓｅ)是一种不同于几丁质酶的新 害症状、与宿主植物互惠共生的真菌( Ａｂｄａｌｌａ ＆
酶以来ꎬ壳聚糖酶的基础与应用研究已成为目前的 Ｍａｔａｓｙｏｈꎬ２０１４)ꎮ Ｒａｊｕｌｕ ｅｔ ａｌ.(２０１１) 首次从陆生
研究热点ꎮ 壳聚糖酶不水解胶态几丁质ꎬ但能够水 植物内生真菌中筛选产几丁质修饰酶的菌株ꎬ发
解完全脱乙酰化的壳聚糖ꎬ所以该酶被认为是专一 现其中 ３７％的内生真菌可产生多种类型的壳聚糖
性水解线性壳聚糖的酶ꎬ主要存在于真菌、细菌及 酶ꎮ Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ ｅｔ ａｌ. ( ２０１５) 从海藻和海草的

植物中(鲁晶娣等ꎬ２０１８)ꎮ 近年来ꎬ大量研究表明ꎬ １１７ 株内生真菌中发现 ４１％的菌株产生的壳聚糖
壳聚糖酶可以作为生物防治剂ꎬ能提高植物的抗病 酶可水解脱乙酰度为 ５６％ 的壳聚糖ꎬ６６％ 的菌株
能力ꎬ与细胞壁的降解、营养代谢等均密切相关ꎬ在 产生的壳聚糖酶可水解脱乙酰度为 ３８％ 的壳聚
回收利用甲壳素中的氮和碳素等方面也起着重要 糖ꎬ５６％的菌株产生的壳聚糖酶可水解脱乙酰度
的作用(Ｋｏｕｚａｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１２ꎻＴｈａｄａｔｈｉｌ ＆ Ｖｅｌａｐｐａｎꎬ２０１４ꎻ 为 １.６％的壳聚糖ꎮ Ｒａｊｕｌｕ ｅｔ ａｌ.(２０１１) 和 Ｖｅｎｋａｔ￣
Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１７ꎻ鲁晶娣等ꎬ２０１８)ꎮ 此外ꎬ ａｃｈａｌａｍ ｅｔ ａｌ.(２０１５) 的研究均发现来源于不同植
其水解产物壳寡糖具有抗菌、抗肿瘤、抗氧化、促进 物的同种内生菌的酶具有高度多样性ꎮ

伤口愈合等多种独特的生理活性和功能ꎬ在医药、 植物中普遍含有内生真菌ꎬ种类繁多ꎮ 从植
食品、化妆品等领域中具有广阔的应用前景(Ａａｍ ｅｔ 物内生真菌中筛选产壳聚糖酶菌株将有利于发现
ａｌ.ꎬ２０１０ꎻＰａｒｋ ＆ Ｋｉｍꎬ２０１０ꎻＪａｉｓｗａｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１９)ꎮ 种类丰富多样的壳聚糖酶ꎬ也将有利于水解产生
不同微生物来源的壳聚糖酶的种类及性质具 多种不同类型的壳寡糖ꎬ为农业、医药业及食品工
有较大差异ꎮ 植物内生真菌是探索不同种类壳聚 业等提供更多有利资源ꎮ 本研究从柑橘和血散薯
糖酶及发现新酶的资源宝库( Ｒａｊｕｌｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１１ꎻ 的 １２２ 株内生真菌中筛选产壳聚糖酶的菌株ꎬ初
Ｖｅｎｋａｔａｃｈａｌａｍ ｅｔ ａｌ.ꎬ２０１５)ꎮ 目前ꎬ对植物内生真 步研究酶活力影响因素ꎬ为后续进一步研究其酶
菌壳聚糖酶的研究仍然极少ꎮ 植物内生真菌是指 学特性和功能、明确产壳聚糖酶内生真菌与宿主
在其生活史中的某一阶段或全部阶段生活在健康 植物互作关系等奠定基础ꎮ