Page 75 - 《广西植物》2020年第9期

１ ２ ９ ０ 广 西 植 物 ４０ 卷
根膨大及贮藏的分子机理提供参考ꎬ为牛大力膨
大根优良品种的选育及将来转基因培育牛大力等
后期基因工程研究提供理论依据和基因资源ꎮ

１ 材料与方法

１.１ 材料

牛大力植株采集于广西百色市那坡ꎬ经广西
药用植物园白隆华研究员鉴定为豆科美丽崖豆藤
(Ｍｉｌｌｅｔｔｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ)的干燥根ꎬ两年生ꎮ 取同一个植
图 １ 牛大力淀粉酶 ＯＲＦ
株中膨大根( 肉质明显ꎬ较软ꎬ易折断ꎬ较脆ꎬ直径
Ｆｉｇ. １ ＯＲＦ ｏｆ ａｍｙｌａｓｅ ｏｆ Ｍｉｌｌｅｔｔｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ
大于 ２.５ ｃｍ)和不膨大根(肉质不明显ꎬ纤维性大ꎬ
较硬ꎬ不易折断ꎬ直径小于 １ ｃｍ)ꎬ以该牛大力膨大

根和不膨大根植物材料进行转录组测序ꎮ
１.２ 方法
由武汉华大医学检验所有限公司在 Ｉｌｌｕｍｉｎａ
ｈｉＳｑ２５００ 平台对牛大力膨大根和不膨大根进行转
录组测序并进行序列分析ꎮ
基于牛大力根的转录组测序数据及其注释结
果ꎬ将搜索到的注释为淀粉酶的 ｕｎｉｇｅｎｅ 通过开放
阅读框 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ 和预测保守域 ＣＤＳ Ｓｅａｒｃｈ 在线
软件检测确认( 图 １)ꎮ 使用 ＥｘＰＡｓｙ 软件对牛大 图 ２ 牛大力淀粉酶碱基序列二维码
力淀粉酶基因编码的氨基酸序列的理化特性进行 Ｆｉｇ. ２ Ｂａｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ａｍｙｌａｓｅ ｏｆ Ｍｉｌｌｅｔｔｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ

在线预测ꎬ并进行跨膜结构域预测( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ.
２.１ 牛大力淀粉酶基因家族成员的一级结构预测
ｃｂｓ.ｄｔｕ.ｄｋ / ｓｅｒｖｉｃｅｓ/ ＴＭＨＭＭ)ꎮ
使用 ＳｉｇｎａｌＰ￣５.０ 及 ＴａｒｇｅｔＰ １.１ Ｓｅｒｖｅｒ 分别对 ２.１.１ 牛大力淀粉酶基因家族成员的鉴定与理化
２８ 条牛大力淀粉酶序列进行信号肽预测和亚细胞 性质分析 基于牛大力根系转录组测序结果ꎬ搜
定位ꎮ 使用 ＳＷＩＳＳ￣ＭＯＤＥＬ 在线工具分别对牛大 索到注释为淀粉酶基因的 ｕｎｉｇｅｎｅ 共有 ２８ 条ꎬ然
力淀粉酶进行二级结构预测及三级结构建模ꎮ 使 后分别经 ＯＲＦ Ｆｉｎｄｅｒ 和 ＣＤＳ Ｓｅａｒｃｈ 确认具有完整
用 ＰｌａｎｔＣＡＲＥ ( Ｌｅｓｃｏｔ ｅｔ ａｌ.ꎬ２００２) 对基因的顺式 开放阅读框 ＯＲＦꎬ最后共鉴定到 ２８ 条牛大力淀粉

调控元件、增强子和抑制子等进行分析ꎮ 基于淀 酶 ｕｎｉｇｅｎｅꎬ命名为 ＭｓＡｍ１ 到 ＭｓＡｍ２８(表 １)ꎬＯＲＦ
Ｆｉｎｄｅｒ 在线预测其编码的淀粉酶前体氨基酸数目
粉酶的氨基酸序列ꎬ采用 ＭＥＧＡ７.０ 邻接法(Ｎｅｉｇｈ￣
最少 的 为 ＭｓＡｍ２８ ( ２５６ 个)ꎬ 最 大 的 为 ＭｓＡｍ１２
ｂｏｒ￣ｊｏｉｎｉｎｇ)ꎬ构建牛大力淀粉酶系统进化树( ｂｏｏｔ￣
ｓｔｒａｐ ＝ １ ０００)ꎮ 利用 ＭＥＭＥ 在线工具对牛大力淀 (４ １４１个)ꎮ 利用 ＥｘＰＡｓｙ 在线软件对牛大力淀粉
酶基因编码的蛋白质进行理化性质预测结果见表
粉酶基因编码的氨基酸序列 ｍｏｔｉｆ 进行分析ꎮ
１ꎬ牛大力淀粉酶的分子量在 ２０.７８ ~ ３４９.３９ ｋＤａ 之
２ 结果与分析 间ꎬ均为酸性蛋白质ꎬ带正电残基( Ａｒｇ＋Ｌｙｓ) 和带
负电 残 基 ( Ａｓｐ ＋ Ｇｌｕ) 均 为 ０ꎻ 不 稳 定 系 数 显 示
经转录组测序及分析ꎬ从转录组数据中筛选 ＭｓＡｍ１、 ＭｓＡｍ８、 ＭｓＡｍ１５、 ＭｓＡｍ１６、 ＭｓＡｍ１８、
ＭｓＡｍ２１、ＭｓＡｍ２５、ＭｓＡｍ２７、ＭｓＡｍ２８ 为稳定蛋白ꎬ
出 ２８ 个淀粉酶ꎬ其碱基序列可扫描二维码(图 ２)ꎮ