Page 45 - 《广西植物》2022年第12期

１２ 期 王丽娟等: 油橄榄 ＡＰ２ / ＥＲＦ 转录因子鉴定及水胁迫表达分析 ２ ０ ３ ５

转录因子基因表达谱ꎬ利用派森诺基因云在线软
件作基因表达交互热图ꎮ 水分胁迫基因表达谱数 ２ 结果与分析
据的处理及筛选采用 ＦＰＫＭ 对表达量进行标准
化ꎬ保留所有 ＦＰＫＭ 值数据ꎬ对其进行排序ꎬ删除 ２.１ 有参转录组测序数据整理
ＦＰＫＭ 无变化或者变化范围不超过 ５ 倍的数据ꎬ筛 油橄榄‘ＴＹＺ￣１ 号’及‘佛奥’ 在干旱、水淹、正
选出基因表达量变化最大的 １５ 个基因ꎮ 常浇水下的根与叶共 １２ 组文库经上机测序ꎬ得到
１.６ ＲＴ￣ｑＰＣＲ 分析 图像文件ꎬ由 Ｉｌｌｕｍｉｎａ 测序平台自带软件进行转
为了验证转录组测序的结果及目标基因的表 化ꎬ生成 ＦＡＳＴＱ 的原始数据( Ｒａｗ Ｄａｔａ)ꎬ对每个
达模式ꎬ设计特异引物( 表 １)ꎬｔｕｂｕｌｉｎ 作为内参基 样品的下机原始数据( Ｒａｗ Ｄａｔａ) 分别进行统计ꎬ
因ꎬ经 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 检测油橄榄 ＯｅＡＰ２ 基因在‘ＴＹＺ￣１ 包括样品名、Ｑ３０、模糊碱基所占百分比、Ｑ２０(％)
号’和‘佛奥’ 不同处理下的表达情况ꎮ 用 ＳＹＢＲ 和 Ｑ３０(％)ꎬ统计结果见表 １ꎮ 测序数据结果( 表
Ｇｒｅｅｎ (ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)检测特异引物的 ＰＣＲ 产物ꎮ ２５ ２) 显 示ꎬ 所 有 样 品 Ｒｅａｄｓ 总 数 在 ３８ １９１ ０５４ ~
μＬ 反应体系的可选参数如下:２× ＳＹＢＲ 绿色主混 ４６ ９３９ ２７８之间ꎬ碱基总数在 ５ ７２８ ６５８ １００ ｂｐ 以
合物 １２.５ μＬꎬ上下游引物(１０ μｍ / Ｌ)０.５ μＬꎬ模板 上ꎬＱ２０ 碱基百分比均大于 ９６.９１％ꎬＱ３０ 碱基百分
(ｃＤＮＡ)１ μＬꎬｄｄＨ Ｏ １０.５ μＬꎮ 使用 ＰＣＲ 热循环 比 均 在 ９２. ２％ 以 上ꎬ 模 糊 碱 基 所 占 比 例 在
２
仪( ＡＢＩ ７３００ꎻ 应 用 生 物 系 统ꎬ Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙꎬ ＣＡꎬ ０.０００ ７６９％以下ꎬ后经数据过滤去除这些带接头、
ＵＳＡ)ꎮ ＰＣＲ 反 应 程 序: 变 性 程 序 ( ９５ ℃ ꎬ １０ 低质量的 Ｒｅａｄｓꎮ
２.２ 样品基因差异表达分析
ｍｉｎ)ꎬ放大定量程序重复 ４５ 次(９５ ℃ ꎬ １５ ｓꎻ ５７
℃ ꎬ １０ ｓꎻ ７２ ℃ ꎬ １５ ｓꎻ 单次荧光测量)ꎬ熔化曲线 采用 ＤＥＳｅｑ 对基因表达进行差异分析ꎬ表达
程序(６０ ℃ 至 ９５ ℃ ꎬ 加热速度 ０.１ ℃ ｍｉｎ ꎬ 连 差异倍数 ｜ ｌｏｇ ２ＦｏｌｄＣｈａｎｇｅ ｜ > １ꎬ显著性 Ｐ< ０.０５ꎮ
￣１
续荧光测量)ꎬ冷却至 ４０ ℃ ꎮ 以 ｔｕｂｕｌｉｎ 基因作为 不同条件下的样品进行两两比较ꎬ图 １ 为干旱胁迫
基因正常表达的内部调控因子ꎬ通过 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 分 下油橄榄 ２ 个品种基因表达差异分析结果簇状柱形
析每个样品 ３ 个独立的生物学重复和每个生物学 图ꎬ图 ２ 为水淹胁迫下油橄榄 ２ 个品种基因表达差
异分析结果簇状柱形图ꎬ图 １ 中 ＦＤＲ 与 ＦＤＬ 之间差
重复的 ３ 个技术重复ꎮ
异基因数量最少ꎬ差异基因总数为 ９２ 个ꎬ上调差异
表 １ 油橄榄 ＲＴ￣ｑＰＣＲ 检测引物序列 基因数为 ４５ 个ꎬ下调差异基因数为 ４７ 个ꎻＦＲ 与 ＯＬ
之间差异基因数最大ꎬ这是两个品种在正常浇水下
Ｔａｂｌｅ １ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＲＴ￣ｑＰＣＲ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｌｅａ ｅｕｒｏｐａｅａ 的根与叶之间的基因表达差异分析ꎬ差异基因总数
为 ２ ８０３ 个ꎬ上调差异基因数有 １ ０７６ 个ꎬ下调差异
引物名称 序列 ５′￣３′
Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ５′￣３′ 基因数有 １ ７２７ 个ꎮ 图 ２ 中 ＯＳＲ 与 ＯＲ 之间差异基
因数最少为 １ ５５０ 个ꎬ上调差异基因数有 ６９３ 个ꎬ下
ＯｅＡＰ２￣１０１Ｆ ＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＣＣＴＣＣＡ
ＯｅＡＰ２￣１０１Ｒ ＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＡＧＣＴＧＴＧＴＴ 调差异基因数有 ８５７ 个ꎻ除 ＦＲ 与 ＯＬ 外ꎬＦＲ 与 ＦＬ
之间差异基因数最大为 ２ ７９１ 个ꎬ上调差异基因数
ＯｅＡＰ２￣５５Ｆ ＴＡＣＡＧＡＧＧＡＡＴＣＣＧＣＡＴＧＡＧ
为 ９７６ 个ꎬ下调差异基因数为 １ ８１５ 个ꎮ 可见ꎬ在干
ＯｅＡＰ２￣５５Ｒ ＣＧＡＣＡＡＴＴＣＡＴＧＡＣＡＴＡＣＴＴ
旱和水淹胁迫下油橄榄不同品种中根与叶之间的
ＯｅＡＰ２￣４２Ｆ ＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＴＧＡＧＧＡ
差异基因数量较明显ꎮ
ＯｅＡＰ２￣４２Ｒ ＡＴＣＡＣＴＧＣＴＴＡＴＡＴＡＴＣＧＣＡ
２.３ 油橄榄 ＡＰ２ / ＥＲＦ 转录因子家族成员鉴定及理
ＯｅＡＰ２￣２８Ｆ ＴＣＡＧＡＴＡＴＡＴＧＣＣＡＡＣＣＡＴＣ
化性质分析
ＯｅＡＰ２￣２８Ｒ ＴＧＡＣＣＴＡＣＴＴＧＧＧＣＴＣＧＴＧＣ
从油橄榄全基因组中搜索 ＡＰ２ / ＥＲＦ 基因ꎬ共
ＯｅＡＰ２￣２３Ｆ ＧＡＧＧＡＡＴＡＴＧＴＡＣＡＧＡＧＧＣＡ
鉴定出 １１０ 个成员ꎬ该 １１０ 个蛋白质所含氨基酸
ＯｅＡＰ２￣２３Ｒ ＡＧＴＣＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＴＴＧＴ
大小为 １７３ ~ ７１７ ｂｐꎬ平均氨基酸个数为 ３４４ 个ꎮ
ｔｕｂｕｌｉｎＦ ＡＧＡＴＧＡＴＧＡＴＧＡＣＧＡＧＴＡＴＧ
通过 ＥｘＰＡＳｙ ｐｒｏｔｐａｒａｍ ｔｏｏｌ 分析 ＯｅＡＰ２ / ＥＲＦ 蛋白
理化性质ꎬ１１０ 个 ＯｅＡＰ２ / ＥＲＦ 蛋白中 ３７ 个蛋白的
ｔｕｂｕｌｉｎＲ ＧＡＣＧＡＴＧＴＡＴＣＣＧＴＣＴＡＴＣＡ