Page 136 - 《广西植物》2023年第2期
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３ ３ ０ 广 西 植 物 ４３ 卷
ＤＮＡ 进行纯度与浓度检测ꎬＯＤ２６０ / ２８０ 比值应为 ＰＩＣ<０.５ 时ꎬ该位点为中度多态性位点ꎻ当 ＰＩＣ≥
１.７ ~ １.９ꎮ 随后ꎬ通过 １％琼脂糖电泳检验 ＤＮＡ 质 ０.５ 时ꎬ该位点为高度多态性位点ꎮ 计算 ＰＩＣ 值所
￣１
量ꎬ将符合要求的模板 ＤＮＡ 稀释到 ５０ ｎｇμＬ ꎬ 用到的公式(杨国忠等ꎬ２００４)如下:
放置于－２０ ℃ 冰箱中备用ꎮ ｎ ｎ－１
ＰＩＣ ＝ １－Ｐ －２Ｐ Ｐ ２
２
２
１.５ ＰＣＲ 扩增 ｉ ＝ １ ｉ ｉ ＝ １ ｉ ｊ
式中:ＰＩＣ 指多态信息含量ꎻＰ 和 Ｐ 分别表示
ＰＣＲ 扩增反应总体积 为 １０ μＬꎬ其 中 包 含 ２ ｉ ｊ
第 ｉ 个和第 ｊ 个等位基因频率ꎻｎ 表示等位基因数ꎮ
￣１
μＬ ＤＮＡ(５０ ｎｇμＬ )ꎬ１ μＬ ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒ( １０ ×)ꎬ
引物的有效扩增率指能够有效扩增的引物数
０.２ μＬ ｄＮＴＰｓꎬ上下游引物各 ０. ２５、０. ０７ μＬ Ｔａｑ
量与引物总数量的比值ꎮ 引物的多态性比率指具
￣１
ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ( ５ Ｕ μＬ )ꎬ 以 及 ６. ２３ μＬ 的
有能够有效扩增且多态性的引物数量与引物总数
ｄｄＨ Ｏꎬ该扩增反应在 ＰＣＲ 仪上完成ꎮ ＳＳＲ￣ＰＣＲ
２
量的比值ꎮ
扩增的程序:９４ ℃ 预变 ４ ｍｉｎꎬ９４ ℃ 变性 １５ ｓꎬ５５
℃ 复变性 １５ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ３０ ｓꎬ３０ 个循环ꎬ７２ ℃ 延
２ 结果与分析
伸 ２０ ｍｉｎꎬ１２ ℃ 保存ꎮ
１.６ 引物有效性及多态性检测
２.１ 枫香转录组中 ＳＳＲ 位点的分布特点
将 ＰＣＲ 扩增后的产物通过 ８％聚丙烯酰胺凝
通过枫香转录组测序共挖掘到 ２３ ７７７ 个枫香
胶电泳进行分离ꎮ 实验步骤:使用移液枪吸取 １.２
ＳＳＲ 位点ꎬ平均每 ３.１３ ｋｂ 存在 １ 个 ＳＳＲ 位点ꎮ 通
μＬ 的滴加了溴酚蓝指示剂的扩增引物点在聚丙
过统计发现ꎬ枫香转录组中 ＳＳＲ 主要有单核苷酸
烯酰 胺 胶 板 上ꎬ 凝 胶 首 尾 点 １ μＬ ５０ ~ ５００ ｂｐ
及二到六个核苷酸等 ６ 个简单重复单元类型ꎮ 此
Ｍａｒｋｅｒꎬ在 ２４０ Ｖ 恒压下电泳ꎬ通过溴酚蓝指示剂
外ꎬ还有少量复杂重复类型( 表 ２)ꎬ其中单核苷酸
调整电泳时间ꎻ电泳结束后ꎬ将凝胶使用 ｄｄＨ Ｏ 清
２
洗 ２ 次ꎬ放入固定液中震荡 １０ ｍｉｎꎬ随后取出凝胶 类型占 ＳＳＲ 位点总数的 ４６.５４％ꎬ二核苷酸重复类
放入超纯水中震荡清洗 ２ ~ ３ 次ꎬ每次 ２ ｍｉｎꎻ清洗 型占 ＳＳＲ 位点总数的 ３３.１０％ꎬ三、四、五、六核苷
后ꎬ将胶板放入银染液中进行银染ꎬ震荡 ７ ｍｉｎꎬ银 酸类型分别占 ＳＳＲ 位点总数的 １７.８０％、１.１７％、
０.４９％、０.８８％ꎮ 单核苷酸类型中ꎬ出现频率最高
染后再次放入蒸馏水中震荡清洗 ２ ~ ３ 次ꎬ每次 ２
ｍｉｎꎻ将清洗后的凝胶放入显影液中震荡ꎬ直至胶 的是 Ｔ / Ａ(６６.８１％)ꎬ其次是 Ａ / Ｔ(２４.９９％)ꎻ二核
板上出现清晰条带为止ꎻ用 ｄｄＨ Ｏ 清洗凝胶 ２ 次 苷酸类型中ꎬ出现频率最高的是 ＣＴ / ＡＧ(２４.７％)ꎬ
２
较之稍少的是 ＴＣ / ＧＡ( ２３. ７２％)ꎻ三核苷酸 类 型
后读条带ꎬ并拍照保存ꎮ
１.７ 数据统计分析 中ꎬ出现最多的是 ＣＡＧ / ＣＴＧ( ６. １７％)ꎬ次之的是
人工进行条带判读ꎬ通过是否扩增出有效条 ＧＡＡ / ＴＴＣ (５.０８％)ꎻ四核苷酸类型中ꎬ出现最多的
带判断引物有效性ꎮ 对具有有效性的引物ꎬ其不 是 ＴＴＴＡ / ＴＡＡＡ ( １７. ２％)ꎻ 五 核 苷 酸 类 型 中ꎬ
同扩增产物按条带长度从大到小用 Ａ、Ｂ、Ｃ进 ＣＴＴＴＴ/ ＡＡＡＡＧ(８.６２％) 出现频率最高ꎻ六核苷酸
行编号ꎬ汇总后通过 Ｐｏｐｇｅｎｅ ３２ 软件计算以下参 类 型 中ꎬ 出 现 最 多 的 是 ＡＣＣＡＧＣ / ＧＣＴＧＧＴ
(４.７２％)ꎮ可见ꎬ枫香 ＳＳＲ 位点以单核苷酸、二核
数:( １) 观 测 等 位 基 因 数 目 ( ｏｂｓｅｒｖｅｄ ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
苷酸为主ꎬ共占 ＳＳＲ 位点总数的 ７９.６４％ꎬ适用于
ａｌｌｅｌｅｓꎬＮａ)ꎻ ( ２) 有 效 等 位 基 因 数 目 ( ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ
设计引物的三到六核苷酸重复类型位点总数仅占
ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ａｌｌｅｌｅｓꎬ Ｎｅ) ( Ｈａｒｔｌ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９８９ )ꎻ ( ３ )
位点总数的 １９.４６％ꎬ限制了在此基础上开发枫香
Ｓｈａｎｎｏｎ 多样性指数( Ｓｈａｎｎｏｎ’ ｓ ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ ｉｎｄｅｘꎬＩ)
(Ｓｈａｎｎｏｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９４９)ꎻ(４) 观测杂合度( ｏｂｓｅｒｖｅｄ ＳＳＲ 引物的数量ꎮ
ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎬ Ｈｏ )ꎻ ( ５ ) 期 望 杂 合 度 ( ｅｘｐｅｃｔｅｄ 由表 ３ 可知ꎬＳＳＲ 重复次数在 ５ ~ ７８ 次之间ꎬ
ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎬＨｅ) ( Ｎｅｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９７３)ꎮ 通 过 ＰＩＣ￣ 主要集中在 ５ ~ ２４ 次之间ꎮ 其中ꎬ重复次数数量在
ＣＡＬＣ 软 件 计 算 ＰＩＣ ( ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ＳＳＲ 总位 点 数 量 中 占 比 最 多 的 是 ５ ~ ８ 次ꎬ 共 有
ｃｏｎｔｅｎｔ)值( Ｂｏｔｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ.ꎬ １９８０)ꎮ ＰＩＣ 值指多态 ８ ７８７个ꎬ占 ＳＳＲ 位点总数的 ３６.９６％ꎻ排在第二位
信息含量ꎬ是判断 ＳＳＲ 引物多态性的重要指标ꎬ当 的是 ９ ~ １２ 次重复ꎬ共有 ８ ４１７ 个ꎬ占 ＳＳＲ 位点总
ＰＩＣ≤０.２５ 时ꎬ该位点为低度多态性位点ꎻ当 ０.２５< 数的 ３５.４０％ꎻ 重复次数在 １３ ~ １６ 次、 １７ ~ ２０ 次和
