Page 135 - 《广西植物》2023年第2期

２ 期 李辉等: 基于转录组测序的枫香 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物开发及有效性评价 ３ ２ ９

(孙荣喜ꎬ２０１７)来开发枫香 ＳＳＲ 引物ꎬ这两个方法 表 １ 枫香实验材料来源地
都存在获得位点信息较少、开发引物难度大、开发 Ｔａｂｌｅ １ Ｓｏｕｒｃｅｓ ｏｆ Ｌｉｑｕｉｄａｍｂａｒ ｆｏｒｍｏｓａｎａ
数量较少的问题ꎬ由此使得当前枫香 ＳＳＲ 引物数 ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｍａｔｅｒｉａｌｓ
量还不足以支撑更深入地进行枫香群体遗传学 经度和纬度
编号 材料来源
Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ ａｎｄ
研究ꎮ Ｎｏ. Ｓｏｕｒｃｅ ｏｆ ｍａｔｅｒｉａｌ ｌａｔｉｔｕｄｅ
本研究以河池市 ７ 个县( 区) 及贵州荔波县 广西河池南丹县
Ａ１ꎬＢ１－Ｂ４ １０７°２０′５６″ Ｅ、
为区域ꎬ依托转录组测序技术获得丰富且全面的 Ｎａｎｄａｎ Ｃｏｕｎｔｙꎬ Ｈｅｃｈｉꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ ２５°２３′３８″ Ｎ
枫香 ＳＳＲ 位点信息ꎬ进行枫香 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物的筛 Ａ２ꎬＢ５－Ｂ６ 广西河池天峨县 １０７°１１′３０″ Ｅ、
Ｔｉａｎ’ｅ Ｃｏｕｎｔｙꎬ Ｈｅｃｈｉꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ ２５°０８′０６″ Ｎ
选和设计ꎬ随后采用 ＰＣＲ 扩增及聚丙烯酰胺凝胶
广西河池凤山县 １０６°５４′４４″ Ｅ、
电泳的 方 法 筛 选 出 多 态 性 好、 扩 增 稳 定 的 枫 香 Ａ３ꎬＢ７－Ｂ８ Ｆｅｎｇｓｈａｎ Ｃｏｕｎｔｙꎬ Ｈｅｃｈｉꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ ２４°３１′５６″ Ｎ
ＥＳＴ￣ＳＳＲ 引物ꎬ并通过对野生群体的遗传多样性 广西河池东兰县 １０７°２９′１０″ Ｅ、
Ａ４ꎬＢ９－Ｂ１０
分析以验证引物的应用效果ꎮ 本研究拟讨论以 Ｄｏｎｇｌａｎ Ｃｏｕｎｔｙꎬ Ｈｅｃｈｉꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ ２４°２７′３８″ Ｎ
广西河池金城江区 １０８°３３′３６″ Ｅ、
下问题:(１) 枫香 ＳＳＲ 位点的具体分布及主要的 Ａ５ꎬＢ１１－Ｂ１４ Ｊｉｎｃｈｅｎｇｊｉａｎｇ Ｄｉｓｔｒｉｃｔꎬ Ｈｅｃｈｉꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ ２４°３４′５８″ Ｎ
序列特征ꎻ( ２) 枫 香 ＳＳＲ 引 物 的 开 发 效 率ꎬ以 及 广西河池环江县 １０８°３３′３１″ Ｅ、
Ａ６ꎬＢ１５－Ｂ１８
影响开发效率的原因ꎻ( ３) 开发出的枫香 ＳＳＲ 引 Ｈｕａｎｊｉａｎｇ Ｃｏｕｎｔｙꎬ Ｈｅｃｈｉꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ ２５°１７′１６″ Ｎ
物多态性情况及在枫香遗传多样性分析当中的 广西河池宜州区 １０８°４５′５２″ Ｅ、
Ａ７ꎬＢ１９－Ｂ２１ Ｙｉｚｈｏｕ Ｄｉｓｔｒｉｃｔꎬ
２４°３４′１７″ Ｎ
应用效果ꎮ 以期为今后枫香分子标记辅助育种、 Ｈｅｃｈｉꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ
功能基因标记等提供基础依据ꎬ为枫香群体遗传 Ａ８ꎬＢ２２－Ｂ２４ 贵州荔波县 １０８°０７′５５″ Ｅ、
Ｌｉｂｏ Ｃｏｕｎｔｙꎬ Ｇｕｉｚｈｏｕ ２５°１５′２５″ Ｎ
学及遗传育种提供可靠研究工具ꎬ为进一步开展
广西河池环江县 １０８°３３′０２″ Ｅ、
广西境内枫香种质资源遗传多样性评价等提供 Ｃ１－Ｃ３０ Ｈｕａｎｊｉａｎｇ Ｃｏｕｎｔｙꎬ Ｈｅｃｈｉꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ ２５°１８′４１″ Ｎ
参考ꎬ为枫香育种材料遗传多样性及亲缘关系分
析奠定基础ꎮ
及 是 否 有 污 染ꎻ Ｎａｎｏｄｒｏｐ 检 测 ＲＮＡ 的 纯 度
(ＯＤ２６０ / ２８０ 比值)ꎻＱｕｂｉｔ 对 ＲＮＡ 浓度进行精确
１ 材料与方法
定量ꎻＡｇｉｌｅｎｔ ２１００ 精确检测 ＲＮＡ 的完整性ꎬ从而

１.１ 材料 保证 ＲＮＡ 的完整性和总量ꎮ (２) 使用 Ｏｌｉｇｏ( ｄＴ)
磁珠富集的方法构建全长转录组文库:在 ＰＣＲ 扩
从广西河池市环江县随机选择 １ 个枫香天然群
增富集合成 ｃＤＮＡ 时ꎬ通过循环优化确定 ＰＣＲ 的
体ꎬ采集其新鲜的红、黄、绿 ３ 种颜色的叶片分别装
最佳条件ꎬ从而保证文库构建质量ꎻ经检验合格
入 ５０ ｍＬ 离心管ꎬ并放入液氮中冷冻封存ꎬ交由北京
后ꎬ根据 文 库 的 有 效 浓 度 及 数 据 产 出 需 求 运 用
诺禾致源生物信息科技有限公司进行转录组测序ꎮ
ＰａｃＢｉｏ Ｓｅｑｕｅｌ 平台进行测序ꎬ从而保证最终得到
经查阅文献并实地考察ꎬ从广西河池市 ７ 个县(区)
的 ＳＳＲ 位点信息有效可靠ꎮ
及贵州荔波县各选择 １ 个枫香天然群体随机采集 １
１.３ 枫香 ＥＳＴ￣ＳＳＲ 标记开发
个枫香样本(Ａ１－Ａ８) 用作引物的初步筛选ꎬ另在 ８
个天然群体中各采集 ２~４ 个枫香样本(各采样单株 对转录组测序挖掘到的枫香转录组中 ＳＳＲ 位
之间相距>５０ ｍ)ꎬ共计 ２４ 个枫香样本(Ｂ１－Ｂ２４)用 点进行筛选ꎬ筛选的标准是序列长度单位范围为
作引物的复筛及多态性检测材料ꎬ从而保证实验材 １６ ~ ２８ ｂｐꎬ２ 个碱基单元的重复次数大于 ９ 次ꎬ３ ~
６ 个碱基单元的重复次数为 ５ 次或大于 ５ 次ꎬ单碱
料能够覆盖该试验区更多天然群体及个体ꎻ此外ꎬ
基单元排除在外ꎬ上、下游引物退火温度差不超过
在河池市环江县另选择 １ 个枫香天然群体采集 ３０
个样本( Ｃ１ －Ｃ３０) 用作遗传多样性分析的实验材 ３ ℃ 等ꎬ将符合条件的枫香转录组开发设计 ＳＳＲ 引

料ꎮ 材料具体来源如表 １ 所示ꎮ 物ꎬ交由广州艾基生物有限公司进行引物合成ꎮ
１.２ 枫香转录组测序 １.４ 枫香基因组 ＤＮＡ 提取
主要从以下方面对测序过程进行把控ꎮ (１)样 使用快捷型基因组 ＤＮＡ 提取系统提取枫香
品质量检测:琼脂糖凝胶电泳分析 ＲＮＡ 降解程度以 ＤＮＡ(王茜等ꎬ２０１３)ꎬ用分光光度计对提取后的