Page 133 - 《广西植物》2024年第2期

２ 期 李竹梅等: 花魔芋软腐病原真菌分离鉴定 ３ ３ ５

种的方法研究表明尖孢镰刀菌对不同品种魔芋 究区域ꎬ针对花魔芋软腐病球茎ꎬ采用真菌组织分
球茎致病力存在着差异ꎻ赵兴丽等(２０２２) 分离鉴 离方法ꎬ通过形态学鉴定和分子生物学手段以及
定了魔芋茎腐病的病原菌ꎬ也从病样分离鉴定出 科赫氏法则检测ꎬ并利用所分离病原真菌与魔芋
尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌 ２ 个种ꎬ但致病性检测 软腐病原细菌进行双回接试验ꎬ拟探讨以下问题:
发现尖孢镰刀菌菌株( ｘｙｍｙ￣８) 无致病性ꎬ腐皮镰 (１)魔芋软腐病病原物种类是真菌、细菌亦或复合
刀菌( ｘｙｍｙ￣７、 ｘｙｍｙ￣９) 有 致 病 性 且 致 病 性 有 差 病害ꎻ(２)魔芋软腐病病原真菌的种类、分类地位
异ꎮ 主流观点认为魔芋软腐病病原菌为细菌( 徐 和病害特征如何ꎮ 以期为云南地区魔芋软腐病的

炜ꎬ ２０１１ꎻ Ｗｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０１５ꎻ Ｗｅｉ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２０ꎻ 精准防治提供理论依据ꎮ
Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２２) ꎬ但研究发现云南曲靖市地区
储存期魔芋球茎发病会在病组织处长出大量真 １ 材料与方法
菌菌丝ꎬ田间发病植株取样放置后也会在极短的
时间内长出大量菌丝ꎬ甚至在田间也能发现软腐 １.１ 试验材料
病组织处有真菌菌丝长出ꎮ 魔芋软腐病原细菌 发病花魔芋球茎采自云南省曲靖市富源县、
侵染特征相关研究表明ꎬ病原菌不能直接通过自 沾益区和陆良县魔芋种植基地ꎬ详见表 １ꎮ 魔芋发
然孔口侵染魔芋块茎ꎬ只能通过芽鞘、伤口侵染 病症状如图 １ 所示ꎬ植株叶片发黄ꎬ有萎蔫症状ꎬ
致病( 黄 露 等ꎬ２０１４ꎻＷｕ ｅｔ ａｌ.ꎬ ２０２１) ꎮ 田 间 魔 并会出现倒苗现象ꎬ植株的茎秆和 / 或球茎部位有
芋软腐病能够短期快速传播ꎬ一方面可能由于田 软腐症状ꎬ挖出的球茎发黑腐烂ꎬ散发出臭味( 图
间病 原 菌 累 积ꎬ 雨 水 冲 刷 蔓 延 ( 张 红 骥 等ꎬ １:ＡꎬＢꎬＤ)ꎮ 所采病样在病组织处有大量白色和 /
２０１２) ꎻ另一方面可能是由于病原真菌的侵染为 或黄色真菌菌丝ꎬ有些病样采集时未发现真菌菌
病原细菌侵染提供了通道ꎮ 丝ꎬ但在温放置后会在极短的时间内长出大量真
本研究以云南省曲靖市魔芋产业种植区为研 菌菌丝(图 １:ＢꎬＣ)ꎮ

表 １ 样地概况
Ｔａｂｌｅ １ Ｇｅｎｅｒａｌ ｓｉｔｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ｓｉｔｅｓ
样地 采样时间 海拔 纬度 经度
Ｓａｍｐｌｅ ｓｉｔｅ Ｓａｍｐｌｉｎｇ ｔｉｍｅ Ａｌｔｉｔｕｄｅ (ｍ) Ｌａｔｉｔｕｄｅ Ｌｏｎｇｉｔｕｄｅ
富源县 Ｆｕｙｕａｎ Ｃｏｕｎｔｙ ２０１９－０８－１５ １ ９６４ ２５°４３′０″ Ｎ １０４°１２′１３″ Ｅ
沾益区 Ｚｈａｎｙｉ Ｄｉｓｔｒｉｃｔ ２０１９－０８－１６ ２ ００４ ２５°５４′３６″ Ｎ １０３°４８′２８″ Ｅ
陆良县 Ｌｕｌｉａｎｇ Ｃｏｕｎｔｙ ２０１９－０８－１６ １ ８７５ ２５°０７′１２″ Ｎ １０３°４７′５４″ Ｅ

１.２ 试验方法 １.２.２ 形态学鉴定 将分离纯化的菌株培养一周
１.２.１ 菌株的分离纯化 (１) 真菌分离:取具有软 后ꎬ制作产孢菌株的临时玻片ꎬ用复合式显微镜
腐病状的花魔芋球茎ꎬ流水冲洗掉表面泥土ꎬ取发 (Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ５３) 观察菌株的菌丝、产孢结构及孢
病与健康交界处组织切成 ０.３ ｃｍ 左右小块ꎻ７５％ 子结构特征并拍照ꎬ使用 Ｉｍａｇｅ ＦｒａｍｅＷｏｒｋ 软件测
的乙醇浸泡 ３０ ｓ 对样品组织表面消毒ꎬ无菌水冲 量其孢子大小( 每个菌株选择 ２０ 个孢子)ꎮ 具体
洗 ３ 次ꎻ将 ３ ~ ５ 块消毒后的组织块转移到 ＰＤＡ 参考« 真菌鉴定手册» ( 魏 景 超ꎬ１９７９) 进 行 形 态
(培养基中含 ３‰乳酸) 平板ꎬ均匀排布ꎬ编号ꎬ用 鉴定ꎮ
封口膜封口ꎻ２５ ℃ 培养箱中暗培养 ２ ~ ５ ｄꎮ (２)真 １.２.３ 分子生物学鉴定 从纯化后的真菌培养皿
菌纯化:培养 ２ ~ ５ ｄ 后ꎬ组织块周围长出不同颜色 中刮取菌丝ꎬ置于 １.５ ｍＬ 离心管中ꎬ用液氮研磨ꎬ
和形状真菌菌落ꎻ用接种针沿菌落边缘挑取部分 ＣＴＡＢ 法 提 取 真 菌 基 因 组 ＤＮＡꎬ 用 ( ＬＲ０Ｒ: ５′￣

菌丝ꎬ接种至新 ＰＤＡ 平板上ꎬ编号ꎬ培养箱中 ２５ ℃ ＧＴＡＣＣＣＧＣＴＧＡＡＣＴＴＡＡＧＣ￣３′和 ＬＲ５: ５′￣ ＡＴＣＣＴＧＡ
暗培养ꎬ观察并记录其生长情况ꎮ 重复真菌纯化 ＧＧＧＡＡＡＣＴＴＣ￣３′) (Ｖｉｌｇａｌｙｓ ＆ Ｈｅｓｔｅｒꎬ １９９０)与(ＩＴＳ４:
培养操作 ２ 遍ꎮ ５′￣ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３′ 和 ＩＴＳ５: ５′￣ＧＧＡＡＧＴ