Page 162 - 《广西植物》2024年第2期
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３ ６ ４ 广 西 植 物 ４４ 卷
醇、氯化钠、苯酚、浓硫酸、邻苯三酚、盐酸、维生素 ｍｉｎꎬ取上清液ꎬ上样品至 ＤＥＡＥ￣Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ５２ 离子
Ｃ( Ｖｃ)、水 杨 酸、Ｔｒｉｓ 和 硫 酸 亚 铁 等 均 为 国 产 分 柱(２.５ ｃｍ × ４５ ｃｍ)ꎬ依次用超纯水和 ０.１ ~ １.０
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析纯ꎮ ｍｏｌＬ 的 ＮａＣｌ 溶液进行洗脱ꎬ流速为 ５ ｓｄ ꎬ
１.２ 仪器 每管收集洗脱液 ５ ｍＬꎬ每管吸取 １ ｍＬ 采用苯酚－
ＤＺＦ￣６０５０ 真空干燥箱( 上海 － 恒科学仪器有 硫酸法在 ４９０ ｎｍ 处测定吸光度ꎬ以管数为横坐
限公司)、ＡＬＰＨＡ １￣２ ＬＤ ｐｌｕｓ 真空冷冻干燥机( 德 标ꎬ吸光度为纵坐标作洗脱曲线ꎮ
国 Ｍａｒｉｎ Ｃｈｒｉｓｔ 公司)、ＵＶ￣６１００Ｓ 紫外可见光光度 (２)多糖离子交换柱层析制备:称取 １０ ｇ ＡＳＰＳ
计( 上海元析仪器有限公司)、ＸＨ￣Ｔ 漩涡混合器 溶于 ２００ ｍＬ 超纯水中ꎬ依次用 ４.０ Ｌ 超纯水和 ０.３、
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(新宝仪器)、Ｒｅａｃｔｉ￣ｔｈｅｒｍｏ 氮气吹扫仪( Ｔｈｅｒｍｏ)、 ０.６、０.８ ｍｏｌＬ 的 ＮａＣｌ 溶液洗脱ꎬ设定流速为 ５
ＩＣＳ５０００ 离子色谱仪( Ｔｈｅｒｍｏ)、ＯＰＴＩＬＡＢ Ｔ￣ｒｅｘ 示 ｓｄ ꎬ收集洗脱液ꎬ减压浓缩后用截留分子量为
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差检测器(Ｗｙａｔｔ)、ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ￣Ⅱ激光光散射 ３.５ × １０ Ｄａ 的透析袋除去盐及色素ꎬ冻干备用ꎮ
３
检测器(Ｗｙａｔｔ)ꎮ (３)多糖的凝胶过滤层析制备:称取适量上述
１.３ 方法 多糖样品溶于超纯水中ꎬ在１０ ０００ ｒｍｉｎ × ５ ｍｉｎ
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１.３.１ 多糖的提取 采用热水煮提法提取多糖( 谭 条件下离心ꎬ取上清ꎬ上样品于 Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ￣１００ 凝
超杰等ꎬ２０２２)ꎬ称取样品 ３００ ｇꎬ加入 ５.０ Ｌ 超纯水 胶柱(１.５ ｃｍ × １００ ｃｍ)中ꎬ洗脱液为超纯水ꎬ流速
浸泡 ２.０ ｈ 后进行煮提ꎬ收集滤液且浓缩至原体积 为 １０ ｓｄ ꎬ每管收集洗脱液 １０ ｍＬꎬ每管吸取 １
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溶液的 １ / ５ꎬ于 ３ ５００ ｒｍｉｎ 下离心 ５ ｍｉｎꎬ取上清 ｍＬ 用苯酚－硫酸法在 ４９０ ｎｍ 处测定吸光度ꎬ以管
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液ꎬ经 ＡＢ￣８ 大孔吸附树脂柱(１０ ｃｍ × ３０ ｃｍ)除杂 数为横坐标、吸光度为纵坐标绘制洗脱曲线ꎬ合并
脱色后ꎬ加入无水乙醇至浓度 ９５％ꎬ４ ℃ 醇沉 １２ ｈꎬ 洗脱峰ꎬ浓缩冻干保存ꎬ即得纯化后的均一多糖ꎮ
取沉淀ꎬ－３０ ℃ 真空冻干后得粗多糖 ＡＳＰＳꎮ １.３.４ 分子量测定 采用凝胶色谱－示差－多角度
１.３.２ 多糖含量的测定 采用苯酚 － 硫酸法测定 激光光散射色谱系统对多糖分子量进行测定( 胡
‘紫加 １ 号’多糖含量( 于淼等ꎬ２０１９)ꎮ 称取无水 卫珍 等ꎬ２０２０)ꎮ 称 取 适 量 多 糖 样 品 溶 解 于 ０. １
葡萄糖标准品 １０ ｍｇꎬ溶于 １００ ｍＬ 的超纯水中ꎬ依 ｍｏｌＬ 的 ＮａＮＯ 溶液中ꎬ浓度为 １.０ ｍｇｍＬ ꎬ完
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３
次吸取 ０、０.３、０.６、０.９、１.２、１.５、１.８ ｍＬ 的标准溶 全溶解后通过 ０.４５ μｍ 的滤膜过滤ꎬ转移至进样
液于试管中ꎬ超纯水定容至 ２ ｍＬꎬ依次加入 ６％苯 瓶中进行检测ꎬ采用 Ａｓｔｒａ ６ 软件收集和处理数据ꎮ
酚 １ ｍＬ 和浓硫酸 ５ ｍＬꎬ摇匀后放置 ５ ｍｉｎꎬ置沸水 示差检测器:Ｏｐｔｉｌａｂ Ｔ￣ｒＥＸ ( Ｗｙａｔｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ
中反应 １５ ｍｉｎꎬ冷却至室温ꎬ测定 ４９０ ｎｍ 的吸光 ＣＡꎬ ＵＳＡ)ꎻ激 光 光 散 射 检 测 器:ＤＡＷＮ ＨＥＬＥＯＳ
度ꎮ 以质量浓度( μｇｍＬ ) 为横坐标、吸光度为 Ⅱ (Ｗｙａｔｔ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＣＡꎬＵＳＡ)ꎻ凝胶排阻色谱柱
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纵 坐 标 绘 制 标 准 曲 线ꎬ 标 准 曲 线 回 归 方 程: ｙ ＝ [ ＯＨｐａｋ ＳＢ￣８０５ ＨＱ (３００ ｍｍ × ８ ｍｍ)、ＯＨｐａｋ ＳＢ￣
０.０１４ １ｘ ＋ ０.００５ ６ꎬ Ｒ ＝ ０.９９９ ５ꎬ 无 水 葡 萄 糖 在 ８０４ ＨＱ ( ３００ ｍｍ × ８ ｍｍ)、 ＯＨｐａｋ ＳＢ￣８０３ ＨＱ
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１５ ~ ９０ μｇｍＬ 的线性关系良好ꎮ (３００ ｍｍ × ８ ｍｍ)]ꎻ流动相:０.１ ｍｏｌＬ ＮａＮＯ ꎻ
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称取 ＡＳＰＳ １０ ｍｇꎬ超纯水溶解且定容至 ５ ｍＬꎬ 进样量:１００ μＬꎻ流速:０.４ ｍＬｍｉｎ ꎻ洗脱梯度:
取 ２ ｍＬ 于试管中ꎬ加入与上述相同的试剂ꎬ在 ４９０ 等度 １００ ｍｉｎꎬ柱温 ４５ ℃ ꎮ
ｎｍ 处测定吸光度ꎬ通过以下公式计算多糖的含量: １.３.５ 单糖组分分析 采用 Ｔｈｅｒｍｏ ＩＣＳ ５０００ 离子
ｍ × Ｖ × Ｎ 色谱系统ꎬ结合电化学检测器进行单糖组成测定
含量(％)＝ Ｔ × １００ꎮ
６
ｍ × Ｖ × １０ (郭东东等ꎬ２０２１)ꎮ 以岩藻糖、阿拉伯糖、鼠李糖、
０ Ｓ
式中: ｍ 为从标准曲线查到的多糖量( μｇ)ꎻ 半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖、果糖、核糖、半乳糖
Ｖ 为样 品 总 体 积 ( ｍＬ)ꎻ Ｖ 为 测 定 的 样 品 体 积 醛酸、古罗糖醛酸、葡萄糖醛酸和甘露糖醛酸为标
Ｔ Ｓ
６ ６
(ｍＬ)ꎻＮ 为稀释倍数ꎬ本研究取 １ꎻ１０ 为 １ ｇ ＝ １０ 准品ꎮ 称取多糖样品 ５.０ ｍｇ 于色谱瓶中ꎬ加入 １
￣１
μｇꎻｍ 为样品质量(ｇ)ꎮ ｍＬ ２ ｍｏｌＬ 的三氟乙酸( ＴＦＡ) 溶液于 １２１ ℃ 下
０
１.３.３ 多糖的分离纯化 (１) 多糖的离子交换柱线 水解 ２.０ ｈꎬ通氮气ꎬ吹干后加入甲醇清洗吹干ꎬ重
性梯度洗脱分析:称取 １０ ｍｇ ＡＳＰＳ 溶解于 １０ ｍＬ 复甲醇清洗吹干过程 ２ ~ ３ 次至完全除去 ＴＦＡꎬ加
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超纯水中ꎬ在 ４ ℃ ３ ５００ ｒｍｉｎ 条件下离心 １０ 入适量无菌水溶解多糖ꎬ转入色谱瓶中待测ꎮ
