Page 30 - 《广西植物》2025年第4期
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６ ４ ４ 广 西 植 物 ４５ 卷
别为 １０ 次、６ 次、５ 次、５ 次、５ 次和 ５ 次( 潘丽芹 Ｒ￣ｐｒｉｍｅｒ ０.１５ μＬ、第一步得到的 ＰＣＲ 扩增产物 ２
等ꎬ２０１９)ꎬ对 ＳＳＲ 位点的分布特征和重复类型进 μＬ 和双蒸水 ７.７ μＬꎮ ＰＣＲ 扩增程序:９５ ℃ 预变性
行统 计 分 析ꎮ 利 用 Ｐｒｉｍｅｒ３ ( Ｒｏｚｅｎ ＆ Ｓｋａｌｅｔｓｋｙꎬ ５ ｍｉｎꎻ９５ ℃变性 ３０ ｓꎬ５２ ℃退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ３０
１９９９)软件进行批量引物设计ꎬ设置退火温度为 ｓꎬ共 ３５ 个循环ꎻ７２ ℃ 延伸 １０ ｍｉｎꎬ保存至 ４ ℃ (孙
５０ ~ ６０ ℃ ꎬ ＧＣ 含量为 ４０％ ~ ６０％ꎬ引物长度 为 荣喜ꎬ２０１７)ꎮ
１８ ~ ２７ ｂｐꎬ产物长度为 １００ ~ ３００ ｂｐꎮ 选择 １００ 对 １.２.５ 毛细管电泳测序 将甲酰胺与分子量内标
雌雄差异表达基因所在位点设计的引物送武汉擎 ＧｅｎｅＳｃａｎ￣５００ＬＩＺ 按 １００ ∶ １ 的体积比混匀之后ꎬ先
科生物科技有限公司进行合成ꎮ 取 １０ μＬ 加入上样板ꎬ再加入 ０.３ μＬ 的 ＰＣＲ 产
１.２.３ 基因组 ＤＮＡ 提取及检测 采用 ＣＴＡＢ 法提 物ꎬ９５ ℃ 变性 ５ ｍｉｎꎬ４ ℃ 冷却后离心ꎬ最后采用
取南酸枣基因组 ＤＮＡꎮ 用紫外分光光度计及 １％ ＡＢＩ ３７３０ｘＬ ＤＮＡ ａｎａＬｙｚｅｒ ( Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓꎬ
琼脂糖凝胶电泳检测 ＤＮＡ 浓度和质量ꎮ 将条带 ＦｏｓｔｅｒꎬＣＡꎬＵＳＡ)进行 ２ 重或 ３ 重毛细管电泳ꎮ
清晰、纯 度 高、 完 整 度 好 的 ＤＮＡ 样 品 稀 释 至 ５０ １.３ 数据分析
￣１ 对南酸枣转录组 ＳＳＲ 位点分布特征进行统计
ｎｇμＬ ꎬ保存－２０ ℃ 冰箱用于后续实验ꎮ
１.２. ４ 引 物 筛 选 验 证 和 ＰＣＲ 扩 增 首 先ꎬ 采 用 分析ꎬ出现频率 ＝ 检测到的 ＳＳＲ 总位点数/ Ｕｎｉｇｅｎｅｓ
１.５％琼脂糖凝胶电泳对 １００ 对引物进行初步筛 总序列数(黄建敏等ꎬ２０１９)ꎮ 采用 ＧｅｎｅＭａｋｅｒ ２.２.０
选ꎬ随机选择 ２ 个样品进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ扩增产物符 软件( Ｌｕｋａｓｈｉｎ ＆ Ｂｏｒｏｄｏｖｓｋｙꎬ１９９８) 对收集的毛细
合预期范围、条带清晰且稳定的引物即为初筛合 管电泳原始峰图进行基因分型ꎻ采用 ＧｅｎＡＩＥｘ ６.５
格引物ꎮ ＰＣＲ 反应体系为 ２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ (Ｐｅａｋａｌｌ ＆ Ｓｍｏｕｓｅꎬ２０１２)软件计算位点期望杂合度
￣１
１２.５ μＬꎬ正反引物各 １ μＬ(１０ μｍｏｌＬ )ꎬＤＮＡ (ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎬＨ )、观测杂合度(ｏｂｓｅｒｖｅｄ
ｅ
模板 １ μＬꎬ双蒸水 ９.５ μＬꎮ 采用 Ｔｏｕｃｈｄｏｗｎ 程序: ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｓｉｔｙꎬＨ )、 有 效 等 位 基 因 数 ( ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｏ
９４ ℃ 预变性 ５ ｍｉｎꎻ９４ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ６３ ℃ 退火 ３０ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｌｌｅｌｅｓꎬ Ｎ ) 和 等 位 基 因 数 ( ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ
ｅ
ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ４５ ｓꎬ１０ 个循环ꎻ９４ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ５５ ℃ ａｌｌｅｌｅｓꎬＮ ) 等遗传参数ꎮ 运用 ＰｏｗｅｒＭａｒｋｅｒ Ｖ ３.２５
ａ
退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃ 延伸 ４５ ｓꎬ２０ 个循环ꎻ７２ ℃ 延伸 ７ (Ｌｉｕ ＆ Ｍｕｓｅꎬ ２００５ ) 软 件 计 算 多 态 信 息 含 量
ｍｉｎꎬ最后 ４ ℃ 保存( 孙荣喜ꎬ２０１７)ꎮ 然后ꎬ选择 ８ (ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｃｏｎｔｅｎｔꎬＰＩＣ)ꎮ
个地理位置相距较远群体中的 ８ 个样品ꎬ采用毛
细管电泳测序对初筛合格的引物进行多态性复 ２ 结果与分析
筛ꎬ筛选出峰值信号强、无杂峰的引物ꎬ作为复筛
合格引物ꎮ 最后ꎬ采用 ９ 个群体的 ８５ 个样品对复 ２.１ 转录组数据组装分析
筛合格的引物进行基于毛细管电泳测序的引物多 由表 ２ 可知ꎬ６ 个样品的有效数据量均在 ５.４７
态性验证ꎮ Ｇ 以上ꎬ 总 共 获 得 ３５. ４０ Ｇ 的 有 效 数 据ꎬ Ｑ２０ 和
毛细管电泳检测采用 ３ 条引物进行扩增:１ 条 Ｑ３０ 均高于 ９６.６３％和 ９０.９６％ꎬＧＣ 含量在 ４２％左
５′端添加 Ｍ１３ 尾巴序列(５′￣ＴＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣ 右ꎬ表明测序质量较高ꎮ 所有原始转录组数据已
ＡＧＴ￣３′)的正向引物、１ 条反向引物以及 １ 条 ５′端标 提 交 至 ＮＣＢＩ ( ＰＲＪＮＡ１１４２２３９ )ꎮ 雌 株 叶 片
有 ＨＥＸ、ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ 和 ＲＯＸ 荧光标记的 Ｍ１３ 尾 (Ｆｅｍａｌｅ￣１、 Ｆｅｍａｌｅ￣２ 和 Ｆｅｍａｌｅ￣３) 测 序 分 别 获 得
巴引物ꎮ ＰＣＲ 扩增采用两步法:第一步ꎬＰＣＲ 采用 ４４ ３２９ ０３８条、４１ ６７６ ５１０ 条和 ４０ １２８ １０４ 条有效
１０ μＬ 反应体系:２ ×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ ５ μＬ、１０ 序列ꎬ雄株叶片( Ｍａｌｅ￣１、Ｍａｌｅ￣２ 和 Ｍａｌｅ￣３) 测序分
￣１ ￣１
μｍｏｌＬ Ｍ１３ ＋ Ｆ￣ｐｒｉｍｅｒ ０.１ μＬ、１０ μｍｏｌＬ Ｒ￣ 别获得 ３６ ７７１ ３００ 条、３６ ５４０ ８３０ 条和 ３７ ２１４ ０１４
ｐｒｉｍｅｒ ０.１ μＬ、ＤＮＡ 模板 １ μＬ 和双蒸水 ３.８ μＬꎮ 条有效序列ꎬ共得到 ２３６ ６５９ ７９６ 条有效序列ꎮ
ＰＣＲ 扩增程序:９５ ℃预变性 ５ ｍｉｎꎻ９５ ℃ 变性 ３０ ｓꎬ 通 过 Ｔｒｉｎｉｔｙ 软 件 组 装 共 得 到 ４０ ３４１ 条
６０ ℃退火 ３０ ｓꎬ７２ ℃延伸 ３０ ｓꎬ共 ２０ 个循环ꎻ７２ ℃ Ｕｎｉｇｅｎｅｓ 序列ꎬ总长度为 ５２ ８０６ ３６９ ｂｐꎮ 平均长度
延伸 １０ ｍｉｎꎬ于 ４ ℃保存ꎮ 第二步ꎬＰＣＲ 采用 ２０ μＬ 为 １ ３０９ ｂｐꎬＧＣ 含量为 ３８.７５％ꎮ Ｕｎｉｇｅｎｅｓ Ｎ５０ 的
反应体系:２×Ｔａｑ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ １０ μＬ、１０ μｍｏｌ 数量和长度分别为 ７ １２３ 条和 ２ ４０９ ｂｐꎬ最大长度
Ｌ Ｍ１３ 荧光标记尾巴引物 ０.１５ μＬ、１０ μｍｏｌＬ 的 和最小长度分别为 １６ ８８９ ｂｐ 和 ２０１ ｂｐꎮ 其中ꎬ长
￣１
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